動物源腸桿菌分離株質粒介導的喹諾酮類耐藥基因的檢測

張 悅，王 楊，張美君，劉雅紅

（華南農業大學獸醫學院 廣東省獸藥研制與安全評價重點實驗室，廣東 廣州 510642）

隨著喹諾酮類藥物在獸醫臨床中的廣泛應用，細菌對其產生耐藥性的問題逐漸顯現出來。最初，人們認為細菌對喹諾酮類的耐藥性應該是由細菌染色體突變引起的，而不太可能存在耐藥性的水平轉移［1］。但近年的研究表明，質粒介導的喹諾酮類藥物耐藥性（PMQR）也是喹諾酮類耐藥機制的重要組成部分，雖然質粒只能介導細菌對喹諾酮類的低水平耐藥，但是這種耐藥機制有助于細菌選擇其他的耐藥機制，從而導致高水平的耐藥。它包括3種主要機制：qnr機制，乙酰基轉移酶Aac（6′）-Ib-cr修飾喹諾酮類藥物的耐藥機制，以及對喹諾酮的主動外排機制。其中qnr機制為最早發現的PMQR機制，由于qnr基因可以編碼一種五肽重復片段蛋白，而這種蛋白可以保護DNA促旋酶及拓撲異構酶IV不受喹諾酮類藥物的作用，從而使細菌對喹諾酮類的敏感性下降［2］，現已發現的qnr基因包括qnrA、qnrB、qnrS、qnrC和qnrD；氨基糖苷類乙酰轉移酶基因aac（6′）-Ib的變異體Aac（6′）-Ib-Cr所編碼的蛋白可以使含有未被取代的哌嗪基的喹諾酮類藥物哌嗪基乙酰化，增強細菌對喹諾酮類的耐藥性［3］；而質粒介導的喹諾酮類外排泵也可以使革蘭陰性菌對喹諾酮類的耐藥性增強，目前發現的此類基因有qepA［4］和oqxAB［5］。

腸桿菌科細菌分布廣，寄主范圍大，可作為原發和繼發病原引起多種動物疾病，本試驗對廣東地區數家養殖場中分離于豬、雞、鴨的腸桿菌進行了PMQR 基 因qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、qnrD、aac（6′）-Ib-cr及qepA 的檢測，并進行獸醫臨床常用抗菌藥物的敏感性試驗，以期對廣東地區近幾年質粒介導喹諾酮耐藥基因在動物體內的分布情況，以及養殖場腸桿菌耐藥情況進行了解，為進一步研究動物源PMQR基因的傳播機制、指導獸醫臨床合理應用抗菌藥物奠定基礎。

1 方法

1.1 菌株來源 2007～2009年在廣東豬、禽養殖場分離的407株腸桿菌，經生化鑒定發現有350株大腸桿菌，26株變形桿菌，21株沙門菌及10株弗勞地枸櫞酸桿菌。質控菌E.coli ATCC 25922為本實驗室保存。

1.2 PMQR基因的檢測 采用水煮法提取菌株DNA。引物序列見表1，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。PCR反應體系為50μL，反應參數為95℃預變性5min；95℃變性45s，退火參數為：qnrA48℃45s、qnrB52℃30s、qnrS52℃30s、qnrC 50℃30s、qnrD 50℃45s、qepA 59℃30s、aac（6′）-Ib-cr55℃45s，共30 個循環，最后72℃延伸10min。取適量擴增產物經1%～2%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統拍照分析。疑似陽性產物送北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。測序結果在GenBank上進行序列比對以確定菌株是否為陽性。

表1 PMQR基因的PCR引物

1.3 藥物敏感性試驗 參照CLSI2007抗菌藥物敏感性試驗執行標準，采用瓊脂稀釋法測定407株腸桿菌對氨芐西林、頭孢曲松、氯霉素、氟苯尼考、四環素、多西環素、萘啶酸、環丙沙星，氧氟沙星、左旋氧氟沙星、恩諾沙星、慶大霉素、卡那霉素、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶進行藥物的敏感性試驗，質控菌采用大腸埃希氏菌ATCC25922。

2 結果

2.1 PMQR基因檢測結果 407株腸桿菌中共有92（22.6%）株攜帶PMQR基因，其中qnrA、qnrB、qnrS、qnrD、qepA 及aac（6′）-Ib-cr 的 分 別檢出4（0.98%）、20（4.91%）、66（16.22%）、7（1.72%）、1（0.25%）、22（5.41%）株，并有27（6.63%）株同時攜帶兩種或兩種以上PMQR基因。PMQR基因陽性株PCR目的片段電泳圖譜見圖1。

圖1 PMQR基因PCR產物電泳圖

2.2 藥物敏感性測定結果 407株腸桿菌對15種藥物耐藥率在由高到低依次為磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、四環素、氨芐西林、氟苯尼考、氯霉素、萘啶酸、卡那霉素、恩諾沙星、慶大霉素、多西環素、環丙沙星、氧氟沙星、左旋氧氟沙星、頭孢曲松，且均表現出多重耐藥（4～15耐），而出現最多的耐藥表型為8耐、9耐、10耐和11耐（表2、表3）。

表2 407株動物源腸桿菌對15種抗菌藥的藥物敏感性試驗結果

表3 407株雞源腸桿菌對15種抗菌藥物的多重耐藥情況

3 討論

407株動物源腸桿菌qnrA、qnrB、qnrS、qnrD、qepA和aac（6′）-Ib-cr的檢出率分別在0.98%、4.91%、16.22%、1.72%、0.25%和5.41%，可以看出，PMQR基因在廣東地區中存在流行，且以qnrS和aac（6′）-Ib-cr為主，與近幾年國內動物源腸桿菌報道有異［10-11］，這可能是由于菌株來源不同，以及地區性差異所導致的。Cavaco等人于2008年首次在河南省分離的人源沙門菌中發現qnrD基因，而本試驗在2007年所分離的動物源腸桿菌中就檢測到7株qnrD陽性菌，由此推測，該基因的出現時間可能更早；同時提示我們，自然界中可能存在其他未被發現的此類耐藥基因。對于廣東地區腸桿菌，Yue等對2003～2005年232株豬源及禽源大腸桿菌的qnrA、qnrB、qnrS及aac（6′）-Ib-cr基因進行檢測，其中qnrB、qnrS及aac（6′）-Ib-cr分別檢出1（0.43%）株，13（5.6%）株及2（0.86%）株，qnrA 沒有檢出［12］。與本試驗相比可以看出，近幾年廣東地區的PMQR流行性明顯增強，而且同時攜帶多個PMQR基因的菌株比例也顯著增加。

在15種抗菌藥物中，受試菌株只對頭孢曲松的敏感率高，達到93.86%，而對于其他多數藥物的耐藥率在30%以上。超過50%的菌株多重耐藥現象較為嚴重（8～11耐）。

本試驗中動物源腸桿菌PMQR基因流行性，以及耐藥率高、多重耐藥的現象嚴重，可能是由于養殖場的不合理用藥、耐藥基因在不同種屬細菌間的水平傳播、細菌在動物和人之間的互相傳遞，以及交叉耐藥導致的，這可能會給養殖業帶來巨大的經濟損失，耐藥性的水平傳播同時也會給人類的健康帶來巨大的隱患。因此規范畜禽養殖用藥，加強對耐藥情況監測是獸醫臨床作業的重要任務。

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