共表達禽流感HA和NA基因重組雞痘病毒免疫犬的安全性和抗體應答

甘軍紀，李賢舟，張勝文，孟 霞，彭大新，劉秀梵

（揚州大學獸醫學院，江蘇 揚州 225009）

犬常與野鳥、家禽以及動物肉產品緊密接觸，增加了禽流感病毒適應并傳播給人的可能性。犬自然感染高致病性禽流感（HPAIV）H5N1已有報道［1］。試驗表明，高致病性禽流感（HPAIV）H5N1可以在犬中水平傳播，犬飼喂感染H5N1AIV的禽肉或氣管內接種可導致臨床發病或死亡［2-3］。目前，還沒有預防犬流感（H5）的疫苗獲得注冊［4］。

雞痘病毒（FPV）具有嚴格的宿主特異性，雖然其不能在哺乳動物體內進行生產性復制，但攜帶外源基因的重組雞痘病毒免疫哺乳動物可產生良好的對表達外源蛋白的免疫應答。近年來，各種不同的用于哺乳動物甚至人的重組禽痘病毒活疫苗試驗廣泛展開，已有用于預防馬流感（H3N8）、馬西尼羅病毒、貓狂犬病、犬瘟熱、貓白血病重組禽痘病毒疫苗獲得注冊［5］。Karaca和Kyriakis等的研究表明，禽流感重組雞痘疫苗（TROVACTM-AIV-H5，美國）在貓和豬上顯示良好的免疫原性［6-7］。本研究用一個共表達H5N1亞型禽流感病毒HA和NA基因的重組雞痘病毒（rFPV-11SH5ANA）免疫犬，評價其生物安全性和抗體應答。

1 材料與方法

1.1 試驗犬與SPF種蛋 同窩非免疫家犬6只，實驗室飼養至9周齡，經檢測無禽流感（H5N1）、犬瘟熱、犬細小病毒等抗體。SPF種蛋，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，本實驗室孵化至10日齡，用于繁殖禽流感病毒或制備雞胚成纖維細胞（CEF）。

1.2 重組雞痘病毒與禽流感病毒 共表達H5N1亞型禽流感病毒HA和NA基因的重組雞痘病毒（rFPV-11SH5ANA），本實驗室構建［8］。雞痘病毒（FPV，282E4株），購自中國獸醫藥品監察所。禽流感病毒（H5N1）G株，本實驗室鑒定和保存。取FPV、rFPV分別接種CEF，進行擴增培養，待80%以上細胞出現病變時收獲，分裝，于-70℃和37℃凍融3次后，進行空斑形成單位（PFU）計數［9］。取禽流感病毒（H5N1）G株種毒接種10日齡SPF雞胚，收獲24～48h死亡雞胚尿囊液，小量分裝，-70℃保存備用。

1.3 動物接種 試驗犬分別編號為犬1～犬6（Dog1～Dog6），隔離飼養。Dog1、Dog2分別皮內接種106PFU 的rFPV-11SH5NA。Dog3、Dog4分別皮下接種106PFU的rFPV-11SH5NA。Dog5皮下接種106PFU的FPV，Dog6皮下注射磷酸鹽緩沖液（PBS），作為空白對照。首次免疫4周后，相同途徑、劑量進行第2次接種。

1.4 安全性試驗 重組雞痘病毒接種前1d和接種后1～7d，每天觀察接種犬接種部位反應（腫脹、疼痛）、精神狀態，監測體溫（肛溫）；采集抗凝血進行全血細胞分類計數，檢測指標按檢測儀（MINDRAY邁瑞，BC-2800vet）設定的參考數據范圍自動判定；采集血清進行肌酐（CREA），胰淀粉酶（AMYL），丙氨酸氨基轉移酶（ALT），血糖（GLU）等指標測定，檢測指標按檢測儀（INDEX，vet Test8008）設定的參考數據范圍自動判定。

1.5 血清學檢測 試驗犬接種重組雞痘病毒前后采血分離血清，-20℃保存備用。AIV的血清抗體應答通過血凝抑制（HI）試驗測定，按常規方法進行［10］。

2 結果

2.1 重組雞痘病毒的安全性 試驗犬皮內和皮下接種重組雞痘病毒（rFPV-11SH5ANA）后，接種部位沒有明顯紅腫等反應，精神狀態正常。接種后1～7d體溫均在正常值范圍 （＜39.5℃），rFPV第2次重復接種后，6d內體溫也在正常值范圍（＜39.5℃），結果見圖1。全血細胞分類計數結果顯示，rFPV接種后1～7d，紅細胞數、白細胞數、血小板數、淋巴細胞數均在正常范圍內；rFPV接種后1～2d，白細胞數和淋巴細胞數出現輕微的下降，第3天起趨于正常（數據未列出）。接種（皮內、皮下）重組雞痘病毒犬7d內部分血清生理生化指標平均值（CREA，AMYL，ALT，GLU）與FPV、PBS接種犬之間無明顯差異，并且均在正常參考值范圍之內，見圖2。表明，共表達H5N1亞型禽流感病毒HA和NA基因的重組雞痘病毒（rFPV-11SH5ANA）接種犬不引起局部和全身性反應，對器官沒有損害作用，具有高度的安全性。

圖1 試驗犬接種重組雞痘病毒（rFPV-11SH5ANA）后的體溫變化。箭頭示第2次接種

2.2 抗體應答 禽流感重組雞痘病毒（rFPV-11SH5ANA）1次免疫犬（106PFU）1～4周血清的AIV HI抗體滴度均＜2，rFPV-11SH5ANA 2次接種犬后1～10周，也未檢測到明顯的AIV HI抗體滴度增加。

圖2 試驗犬接種重組雞痘病毒（rFPV-11SH5ANA）、FPV、PBS前后血清部分生化指標

3 討論

在家禽上，目前已有表達高致病性禽流感、新城疫和傳染性喉氣管炎病毒抗原基因的重組雞痘病毒活疫苗獲得注冊并投入商品應用。重組雞痘病毒活疫苗研究中，對rFPV環境釋放和對哺乳動物的安全性是疫苗生物安全評價的重要方面。過去的研究表明，禽痘病毒中插入外源基因并沒有增強重組禽痘病毒對哺乳動物的毒力。rFPV和rCPV以不同的接種途徑接種小鼠、兔、大鼠、豚鼠、貓、狗、馬、牛和豬沒有副反應［5］。幾個已注冊的用于犬、貓的禽痘載體疫苗包括用于貓的金絲雀痘病毒載體狂犬病疫苗、金絲雀痘載體貓白血病疫苗，用于犬的金絲雀痘載體犬瘟熱疫苗，廣泛的應用沒有發現明顯的副作用［6］。本研究結果進一步表明，禽流感重組雞痘病毒（rFPV-11SH5ANA）具有良好的生物安全性。

為了預防伴侶動物高致病性禽流感病毒（HPAIV，H5）的感染，Karaca等用表達H5N8禽流感病毒的H5血凝素基因的重組雞痘病毒（TROVAC AIV-H5）接種貓，產生抗同源H5N8抗原的高水平抗體。第2次接種后，產生的抗體顯示與HPAIV H5N1新分離株有交叉反應［6］。Stittelaar等用表達HPAIV H5HA基因的重組金絲雀痘病毒（ALVAC H5N1）接種SPF貓，有效地保護了免疫貓對兩個不同抗原型的人HPAIV H5N1病毒的氣管內攻擊；免疫貓攻毒后排毒顯著減少，說明重組金絲雀痘病毒（ALVAC H5N1）接種能有效地減少流感病毒感染貓的病毒傳播［11］。禽流感病毒HI抗體滴度雖然是獲得免疫保護的一個重要指標，但對于重組雞痘病毒免疫哺乳動物而言細胞免疫起主要作用，rFPV-11SH5ANA免疫家犬沒有檢測到有效的AIV HI抗體應答，并不能否定其免疫保護作用，考慮到生物安全因素，本研究未進行攻毒保護試驗，因此，該重組雞痘病毒免疫犬的保護效力尚有待進一步研究。

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