小型豬特異性麻醉頡頏劑對大鼠不同腦區(qū)Na＋，K＋-ATP酶活性的影響

盧德章，范宏剛，王洪斌，張欒松，馬 昆，姜 勝，譚麗娟，于世明

（1.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 712100；2.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

Na＋，K＋-ATP酶（又被稱為鈉泵）普遍存在于各種細胞膜，只有保持此酶的正常活性，才能產(chǎn)生并維持可興奮細胞的膜電位，以維持神經(jīng)細胞的興奮性和傳導性［1］。麻醉藥可通過對Na＋，K＋-ATP酶活性的抑制，改變細胞膜內(nèi)外Na＋，K＋、Ca2＋穩(wěn)態(tài)，影響突觸興奮、突觸傳遞和突觸的遞質(zhì)釋放而產(chǎn)生麻醉作用。小型豬復合麻醉劑-XFM，是依據(jù)平衡麻醉理論和小型豬的生理特點研制成功的一種小型豬專用的麻醉劑［2］。為了更好的將XFM在臨床上推廣應(yīng)用，保障科研試驗后小型豬生理機能快速恢復，東北農(nóng)業(yè)大學小型豬麻醉課題組在XFM的基礎(chǔ)上，研制小型豬特異性麻醉頡頏劑，來頡頏XFM的麻醉作用。本研究旨在探討大鼠在XFM麻醉下被小型豬特異性麻醉頡頏劑催醒時大腦各腦區(qū)Na＋，K＋-ATP酶的變化，擬從離子ATP酶方面揭示小型豬特異性麻醉頡頏劑的催醒作用的分子學機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 XFM和小型豬特異性麻醉頡頏劑由東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院外科教研室配制，超微量Na＋-K＋-ATP酶測定試劑盒及考馬斯亮藍蛋白質(zhì)含量測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；Wistar大鼠144只，雌雄各半，體重210g±20g，黑龍江省中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.2 試驗方法及動物分組 所有的大鼠腹腔注射XFM 0.05mL／10g進行麻醉，然后再隨機取72只為生理鹽水組，其余為試驗組，且生理鹽水組和試驗組又分為早期、中期和晚期催醒組。大鼠分別于注射XFM 后10、30、60min再腹腔注射0.05mL／10 g小型豬特異性麻醉頡頏劑或0.05mL／10g生理鹽水。大鼠分別于翻正反射恢復期（催醒Ⅰ組或?qū)φ闸窠M）及可直線爬行時（催醒Ⅱ組或?qū)φ闸蚪M）各剖殺取材。在生理鹽水冰面上取腦，用4℃生理鹽水將腦上的血跡沖洗干凈，迅速分離雙側(cè)大腦皮層、海馬、小腦、腦干、丘腦，立即液氮冷凍。

從液氮罐中將不同腦區(qū)的腦組織取出，稱重后按1∶9（W／V）置入預冷的生理鹽水溶液中勻漿，然后按差速離心法分離不同腦區(qū)腦突觸體。首先1000r／min離心10min，收集上清液，沉淀用生理鹽水溶液混懸后再按上述方法離心，收集上清液，合并兩次上清液，然后以17000r／min離心55min，棄去上清液，即獲粗制突觸體。用相同緩沖液調(diào)成2g／L的粗制突觸體混懸液，待測ATP酶活性。所有操作均在4℃下進行。采用比色法測定Na＋，K＋-ATP酶活性。酶活力以每小時分解每毫克組織蛋白產(chǎn)生的無機磷的含量（μmol／mg·h）表示。按考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠行為學變化 注射小型豬特異性麻醉頡頏劑后，各試驗組的大鼠均表現(xiàn)出呼吸加快、搖頭和排尿等現(xiàn)象，給予一定的刺激后大鼠可出現(xiàn)體動，隨后開始四肢抖動，然后恢復翻正反射。翻正恢復后，大鼠可以進行斜線爬行或轉(zhuǎn)圈運動，最后大鼠可進行直線爬行。注射小型豬特異性麻醉頡頏劑可以明顯的縮短大鼠的翻正反射恢復時間和直線爬行恢復時間，與對照組相比，差異極顯著（P＜0.01）。具體結(jié)果見表1。

表1 小型豬特異性麻醉頡頏劑對大鼠行為學變化情況（min±SD）

表1 小型豬特異性麻醉頡頏劑對大鼠行為學變化情況（min±SD）

注：①組方內(nèi)數(shù)據(jù)比較：＊＊代表與0min比較P＜0.01，差異極顯著；＊代表與0min比較P＜0.05，差異顯著。②同一時間點組方間數(shù)據(jù)比較：肩標小寫字母不同表示差異極顯著（P＜0.01）；大寫不同表示差異顯著（P＜0.05）；字母相同且大小寫也相同表示差異不顯著（P＞0.05）。下表同

翻正反射恢復時間 直線爬行恢復時間早期 對照組69.83±7.56 73.31±12.33催醒組 試驗組 5.68±1.17＊＊Aa 8.19±1.99＊＊Aa中期 對照組45.54±11.53 49.78±13.32催醒組 試驗組 5.71±1.82＊＊Aa 8.47±2.85＊＊Aa晚期 對照組20.87±5.46 24.60±6.56催醒組 試驗組 5.31±0.59＊＊Aa 8.38±1.34＊＊Aa

2.2 小型豬特異性麻醉頡頏劑對大鼠不同腦區(qū)Na＋，K＋-ATP酶活性的影響 早期催醒的催醒Ⅱ組大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干的Na＋，K＋-ATP酶活性分別較催醒Ⅰ組增加了57.89%（P＜0.01）、60.34%（P＜0.01）、75.23%（P＜0.01）、42.98%（P＜0.01）和33.06%（P＜0.01）。催醒Ⅰ組腦干較對照Ⅰ組增加了26.53%（P＜0.01）。催醒Ⅱ組大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干分別較對照Ⅱ組增加了22.45%（P＜0.01）、14.81%（P＜0.01）、38.41%（P＜0.01）、35.16%（P＜0.01）和25.00%（P＜0.01）。

中期催醒的催醒Ⅱ組大腦皮層、海馬、丘腦和小腦的Na＋，K＋-ATP酶活性分別較催醒Ⅰ組增加了83.81%（P＜0.01）、48.00%（P＜0.01）、45.74%（P＜0.01）和38.83%（P＜0.01）。催醒Ⅰ組海馬和小腦分別較對照Ⅰ組降低12.59（P＜0.01）和18.25%（P＜0.01）；而丘腦和腦干分別較對照Ⅰ組升高了8.40%（P＜0.01）和16.50%（P＜0.01）。催醒Ⅱ組大腦皮層、海馬和丘腦相比對照Ⅱ組高了27.81%（P＜0.01）、8.19%（P＜0.01）和33.33%（P＜0.01）。

晚期催醒的催醒Ⅱ組大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干的Na＋，K＋-ATP酶活性分別較催醒Ⅰ組增加了88.89%（P＜0.01）、59.50%（P＜0.01）、33.57%（P＜0.01）、10.11%（P＜0.01）和41.07%（P＜0.01）。丘腦、小腦和腦干的Na＋，K＋-ATP酶活性在催醒Ⅰ組分別較對照Ⅰ組增加13.82（P＜0.01）、42.40%（P＜0.01）和13.13%（P＜0.05）；而大腦皮層和海馬的催醒Ⅰ組分別較對照Ⅰ組減少15.38%（P＜0.01）和15.97%（P＜0.01）。催醒Ⅱ組大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干分別較對照Ⅱ組25.50% （P＜0.01）、15.57% （P＜0.01）、37.50%（P＜0.01）、47.37%（P＜0.01）和12.86%（P＜0.01）。試驗結(jié)果見表2。

表2 小型豬特異性麻醉頡頏劑對大鼠不同腦區(qū)Na＋，K＋-ATP酶活性的影響 （μmol／mg·h）

表2 小型豬特異性麻醉頡頏劑對大鼠不同腦區(qū)Na＋，K＋-ATP酶活性的影響 （μmol／mg·h）

大腦皮層 海馬 丘腦 小腦 腦干早期催醒組對照Ⅰ組 1.13±0.08DEcd 1.49±0.05Ccd 1.20±0.04Ecd 1.18±0.09Gf 0.98±0.07Gf對照Ⅱ組 1.47±0.09Cb 1.62±0.09Bbc 1.38±0.04Bb 1.28±0.08DEFdef 1.32±0.09BCbcd催醒Ⅰ組 1.14±0.05DEcd 1.16±0.06De 1.09±0.05Fd 1.21±0.04FGef 1.24±0.06CDcde催醒Ⅱ組 1.80±0.07Ba 1.86±0.06Aa 1.91±0.06Aa 1.73±0.06Bb 1.65±0.07Aa中期催醒組對照Ⅰ組 1.11±0.02DEcd 1.43±0.07Cd 1.19±0.06Ecd 1.26±0.03EFGdef 1.03±0.02FGf對照Ⅱ組 1.51±0.03Cb 1.71±0.03Bb 1.41±0.02Bb 1.36±0.02CDcd 1.35±0.09Bbc催醒Ⅰ組 1.05±0.04EFcd 1.25±0.03De 1.29±0.05CDbc 1.03±0.03Hg 1.20±0.05DEde催醒Ⅱ組 1.93±0.04Aa 1.85±0.03Aa 1.88±0.05Aa 1.43±0.03Cc 1.22±0.05CDEcde晚期催醒組對照Ⅰ組 1.17±0.03Dc 1.44±0.08Cd 1.23±0.02DEc 1.25±0.03EFGdef 0.99±0.05Gf對照Ⅱ組 1.49±0.08Cb 1.67±0.07Bb 1.36±0.07BCb 1.33±0.03DEcde 1.40±0.03Bb催醒Ⅰ組 0.99±0.03Fd 1.21±0.04De 1.40±0.03Bb 1.78±0.02Bb 1.12±0.02EFef催醒Ⅱ組 1.87±0.06ABa 1.93±0.06Aa 1.87±0.07Aa 1.96±0.06Aa 1.58±0.05Aa

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)分布有較高的Na＋，K＋-ATP酶，對維持神經(jīng)細胞的興奮性和傳導性、調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和信息傳遞有重要作用，因此Na＋，K＋-ATP酶活性的降低必然影響突觸的化學傳遞作用及神經(jīng)的傳導功能［3］。

有研究發(fā)現(xiàn)，XFM的全麻作用與抑制特定腦區(qū)突觸體Na＋，K＋-ATP酶活性相關(guān)。大腦皮質(zhì)、丘腦、小腦和腦干的Na＋，K＋-ATP酶可能是XFM全麻作用的靶位之一［4］。在本試驗中，早、中、晚期催醒的催醒Ⅰ組海馬和催醒Ⅱ組大腦皮層的Na＋，K＋-ATP酶活性均表現(xiàn)出先升高再降低的趨勢，即Na＋，K＋-ATP酶的活性在早期催醒時最低，在中期催醒時最高，且Na＋，K＋-ATP酶活性的這種變化趨勢與大鼠行為學的變化相一致。分析試驗結(jié)果，推斷大腦皮質(zhì)和海馬的Na＋，K＋-ATP酶可能是小型豬特異性麻醉頡頏劑催醒作用的靶位之一，且小型豬特異性麻醉頡頏劑催醒作用可能與增加這兩個腦區(qū)的Na＋，K＋-ATP酶活性相關(guān)。

海馬的Na＋，K＋-ATP酶大鼠在恢復翻正反射時發(fā)揮主要作用，這是因為海馬是中樞神經(jīng)邊緣系統(tǒng)的一部分，在組織學結(jié)構(gòu)上屬于古皮層，由三層神經(jīng)元構(gòu)成，其中顆粒細胞或錐體細胞是投射神經(jīng)元，它們之間構(gòu)成的三突觸通路是研究藥物對突觸信號傳遞和神經(jīng)元電活動影響的經(jīng)典途徑［5-6］。因此，小型豬特異性麻醉頡頏劑增加海馬的Na＋，K＋-ATP酶才會促使大鼠恢復翻正反射。在我們的研究中同時還發(fā)現(xiàn)，大腦皮層的Na＋，K＋-ATP酶大鼠在恢復直線爬行時發(fā)揮主要作用。大腦皮層含有大量的與運動有關(guān)的神經(jīng)元，在意識和感覺的調(diào)控中起著重要的作用［7］。小型豬特異性麻醉頡頏劑通過增加Na＋，K＋-ATP酶的活性，激活大腦皮層上的運動神經(jīng)元。

然而，研究小型豬特異性麻醉頡頏劑的催醒機理是一個非常復雜的過程，涉及跨膜細胞信號轉(zhuǎn)導、細胞內(nèi)信息轉(zhuǎn)導和離子通道等方面內(nèi)容。研究Na＋，K＋-ATP酶活性只是在跨膜細胞信號轉(zhuǎn)導某一方面揭示小型豬特異性麻醉頡頏劑的催醒機理，其必然還有更為復雜的分子機理不為我們所知，這需要進行更為深入和全面的研究。

4 結(jié)語

大腦皮質(zhì)和海馬突觸體的Na＋，K＋-ATP酶可能是小型豬特異性麻醉頡頏劑催醒作用的靶位之一，且小型豬特異性麻醉頡頏劑催醒作用可能與增加這兩個腦區(qū)的Na＋，K＋-ATP酶活性相關(guān)。

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