吉林白鵝α干擾素在大腸桿菌中的表達及抗病毒活性檢測

李公美，李玉梅，胡靜濤，劉可越，錢愛東

（1.吉林農業大學動物科技學院，吉林 長春 130118；2.吉林大學畜牧獸醫學院，吉林 長春 130062；3.江西九江學院，江西 九江 332000）

干擾素（IFN）是體內一種重要的干擾病毒繁殖的免疫活性細胞因子，由Isaacs等［1］在研究雞胚絨毛尿囊膜中禽流感病毒時首次發現。Ⅰ型干擾素主要由病毒和微生物誘導產生，Ⅱ型干擾素主要由淋巴細胞受有絲分裂原或特異性抗原刺激產生，IFN-α可抑制感染細胞中病毒mRNA翻譯，并促使病毒mRNA降解，能提高細胞表面MHCⅠ類分子的表達水平，有助于向T細胞遞呈抗原，引起靶細胞的溶解，并可增強NK細胞對病毒的殺傷能力［2］。

20世紀80年代以來，人的干擾素基因［3］克隆表達成功后應用到了臨床，獲得了抗病毒的顯著效果，隨后，狗［4］、豬［5］干擾素基因也相繼被克隆，近年來，Digby［6］、Sick和夏春等［7］報道了雞IFN 序列。Schultz等［8］報道了鴨IFN序列，并開展了其抗病毒的研究。但目前關于鵝IFN的報道較少，養鵝業是我國養殖業中重要的支柱產業，鵝絨、鵝羽都是貴重的出口商品，在國際上非常受歡迎，目前我國在客觀上急需大力發展養鵝業。鵝細小病毒、鵝副黏病毒等感染是危害養鵝業最嚴重的大敵。但目前該類疾病的防治相對落后，而且雞、鴨等禽類IFN藥物已經投入生產使用，因此加強鵝IFN的研究顯得尤為重要，本試驗參照有關鴨等禽類IFN的報道，無菌取鵝肝臟，利用動物基因組試劑盒提取鵝肝臟中的總DNA，采用PCR技術，成功克隆獲得吉林白鵝IFN-α基因，并對其進行表達、純化，檢測其抗病毒活性，為進一步研究吉林白鵝IFN抗病毒作用機制及研制防治鵝病毒性疾病的新型制劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、質粒與毒株 含吉林白鵝IFN-α基因的重組質粒pMD-T-IFN-α由吉林農業大學重點實驗室構建，鴨瘟病毒由吉林農業大學重點實驗室保存，E.coli BL21（DE3）、pGEX-6p-1由吉林大學獸醫研究所饋贈。

1.2 主要試劑 限制性內切酶Bam HⅠ、Eco RⅠ、Taq DNA聚合酶及T4DNA連接酶等均購自寶生物工程（大連）有限公司；GST融合蛋白純化試劑盒為Amersham Pharmacia公司產品，低分子質量蛋白質標準、預染蛋白質分子量標準為北京天根有限公司產品；IPTG、DNA分子質量標準、質粒DNA抽提試劑盒、DNA凝膠回收純化試劑盒為杭州維特潔生物技術有限公司產品；酵母浸出粉、胰蛋白胨為Oxoid公司產品；DMEM培養基、小牛血清購自Invitrogen公司。

1.3 引物設計與目的基因PCR擴增 根據Gen-Bank上已發表的鵝IFN-α序列（登錄號：HQ00-9755），用Primer 5.0軟件在其完整的閱讀框架外設計上、下游引物，引物序列分別為P1：5′-ATAAACATGCCTGGGCCATCAG-3′ P2：劃線部分分別為Bam HⅠ和Eco RⅠ 酶切位點，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.4 鵝IFN-α基因的PCR擴增及擴增產物的回收 以重組質粒pMD-T-IFN-α為模板，PCR擴增IFN-α，PCR反應體系：反應體系為：ddH2O 37.5 μL、10×PCR Buffer 5μL、mix dNTPs（10mmol／L）1μL、IFN-αP1（20pmol／L）／IFN-αP2（20pmol／L）各1μL、重組質粒 GoIFN-α（0.5mg／mL）1μL、Ex Taq酶（5μ／μL）0.5μL，補超純水至50μL，混勻。PCR反應條件為：95℃預變性8min，94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環后，72℃延伸10min，0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定反應產物，用凝膠回收純化試劑盒回收目的片段。

1.5 重組表達載體pMD-IFN-α的構建 用Bam HⅠ和Eco RⅠ雙酶切含鵝IFN-α基因T載體，插入到同樣經Bam HⅠ和Eco RⅠ雙酶切的pGEX-6p-1表達載體的大片段中，構建重組質粒pGEXIFN-α。轉化、篩選陽性克隆，提取重組質粒進行PCR和Bam HⅠ、Eco RⅠ酶切鑒定，對初步篩選出的陽性克隆送至寶生物工程（大連）有限公司測序。

1.6 重組質粒pGEX-IFN-α的誘導表達及鑒定將鑒定正確的重組質粒pGEX-IFN-α轉化至表達宿主菌BL21中，挑單個菌落接種于5mL含Amp的LB液體培養基中，37℃、200r／min搖床培養。帶菌液OD值為0.6～1.0時，加入IPTG至終濃度為1.0mmol／L，30℃誘導培養6h后收集菌體，同時設只含表達載體pGEX-6p-1的BL21和誘導后pGEX-6p-1的BL21對照。將誘導表達菌裂解產物進行SDS-PAGE和Western-blot。

1.7 重組鵝IFN-α的純化 根據谷胱苷肽瓊脂糖-4B（Glutathione Sepharose-4B）操作說明書純化GST融合蛋白：（1）將谷胱甘肽瓊脂糖-4B基質轉移至一次性的小柱子。（2）輕扣小柱以除氣泡，然后讓谷胱甘肽瓊脂糖-4B基質著床。（3）移去底蓋。（4）加入10倍體積的1×PBS洗滌2次。（5）在基質中每次加入100μL GST Reduction Elution Buffer洗脫GST融合蛋白。（6）收集洗脫液。用SDSPAGE電泳檢查純化蛋白的純度，用薄層掃描儀進一步掃描分析目的蛋白純度。蛋白經純化后，用紫外分光光度計測定樣品在波長260nm和280nm處的OD值，按照公式計算樣品中蛋白質質量濃度。計算公式為：蛋白質質量濃度（mg／mL）＝（1.45×OD280-0.74×OD260）稀釋倍數。

1.8 定量PCR檢測重組鵝IFN-α抗病毒活性的測定 制備鴨胚成纖維細胞（DEF），待鴨胚成纖維細胞長成單層后分3組：DPV感染細胞陽性對照組、BL21（DE3）／pGEX空載體培養物處理的DPV感染細胞對照組和保護組（加入含2μg／mL重組鴨IFN-α處理18h后感染DPV），DPV強毒的感染量為100PFU。在接毒1h、5h、10h、15h、23h、32h、40h、48h、55h、63h每組分別取2瓶凍存。試驗重復4次，每次間隔7d。按文獻［9］用定量PCR檢測DPV強毒。每日置于倒置顯微鏡下觀察細胞培養板的細胞病變情況，即能看到引起病毒增殖的最高稀釋度，依據Reed-Muench法［10］，計算其鴨瘟病毒的TCID50，采用微量中和試驗測定GoIFN-α的抗病毒效價［11］。

2 結果

2.1 重組質粒pGEX-6p-1的鑒定 對重組質粒pGEX-6p-1進行PCR鑒定，結果在約570bp處得到了1條目的條帶；用Bam HⅠ和Eco RⅠ進行雙酶切鑒定，分別在約4900bp和約570bp處出現1條帶（圖1），與預期結果相符。將經PCR和酶切鑒定為陽性的重組質粒測序，測序結果與鵝IFN-α全基因的編碼序列完全一致。

2.2 重組鵝IFN-α基因的表達及鑒定 SDSPAGE電泳結果顯示，含有重組質粒pGEX-IFN-α的重組菌液出現1條約為43.0ku的融合蛋白（GST-IFN-α）與預期結果相一致；而只含表達載體pGEX-6P-1的BL21，在26.0ku處有1條明顯的蛋白帶（GST）；未含重組質粒和表達載體的宿主菌BL21，沒有出現這一條帶（圖2）。表明重組質粒pGEX-IFN-α在BL21中可誘導表達重組鵝α干擾素融合蛋白。薄層掃描分析結果顯示，表達蛋白占菌體總蛋白的18.6%。SDS-PAGE電泳結束后，將凝膠上的蛋白轉印至硝酸纖維素（NC）上，用GST單抗作一抗，辣根過氧化物酶標羊抗鼠IgG作二抗進行Western-blot檢測。結果（圖3）顯示，融合蛋白43.0ku出現一條特異條帶，同時表達空載體在26.0ku處出現一條帶，因此根據分子質量的大小推測，這條帶的相對分子質量與目的蛋白的相對分子質量相同，表明誘導表達的目的蛋白是重組的鵝α干擾素。

2.3 重組鵝IFN-α的抗DPV強毒活性 定量PCR檢測重組鵝IFN-α不同時間抗DPV強毒的結果（圖4）。在感染后15h內，重組鵝IFN-α組與DPV感染細胞對照組和BL21（DE3）／pGEX空載體培養物對照組差異不顯著（P＞0.05），病毒核酸拷貝數均在105.6～105.2間；從23h開始，鵝IFN-α保護組的核酸拷貝數低于陽性對照組并在感染后47～55h其拷貝數差異達到最大，差異顯著（P＜0.05）。55h時，與陽性對照組的DPV拷貝數相比，鵝IFN-α保護組能減少病毒108.54個核酸拷貝數，相對抑制率80%；DPV感染細胞對照組和空載體培養物對照組各時間段病毒的增殖趨勢和核酸拷貝數基本一致，無統計學差異（P＞0.05）。

圖4 定量PCR檢測重組pGEX-IFN-α抗DPV強毒效果

3 分析與討論

因本試驗做克隆與序列分析時經比對鵝IFN-α與鴨IFN-α同源性為97.2%，因此為探討鵝IFN-α應用于生產的可能性，本試驗選用了對我國養鴨業危害最為嚴重的傳染病之一的DPV強毒為重組IFN-α抗病毒活性的研究對象，同時采用具有高度敏感和特異性的FQ-PCR技術來檢測重組IFN-α對DPV的動態干擾效果。這樣不但可以避免傳統方法［12-13］。

受非特異性因素的各種影響（如干擾素本身可以影響多數細胞的分裂等），客觀的反映了干擾素對病毒復制的抑制效果。DPV感染DEF的最初15 h，病毒處于靜止期，各試驗組差異不顯著；隨后DPV復制開始進入對數期，重組鵝IFN-α抗DPV組的病毒核酸拷貝數低于不加鵝IFN-α的陽性對照組差異顯著（P＜0.05）；陽性組中的DPV在55h附近達到復制高峰，到63h后由于細胞老化會被破壞，病毒量有所減少，而重組鵝IFN-α保護組中病毒增殖期明顯較陽性組慢，在63h時仍未達到陽性組在55h的含病毒量。因此重組鵝IFN-α對DPV的復制有明顯的抑制效果，能抑制DPV強毒在DEF上形成空斑。由于鵝IFN-α是通過抑制病毒核酸的合成達到抗病毒效果，其抗病毒機理與中和抗體不同，具有光譜性。

干擾素作為一種抑制和干擾病毒繁殖的可溶性細胞因子，可刺激機體淋巴細胞分泌產生多種廣譜抗病毒蛋白質，阻斷病毒的繁殖，當干擾素系統被激活后，細胞接觸干擾素只需幾分鐘，就產生抗病毒狀態，動物可在1～3周時間內對其他病毒的重復感染也有抵抗作用［14］，雖然病毒性疾病能誘導機體產生少量干擾素，在體內抑制病毒的增殖，但因表達量低，所以難以保護機體抵抗疾病的侵襲，因此我們希望能通過基因工程方法規?；@得鵝重組干擾素應用到臨床。本試驗為進一步研究鵝IFN-α在抗病毒、抗腫瘤等方面的作用及鵝IFN生物制劑的研究奠定了基礎。

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