豬巨細(xì)胞病毒gB基因的克隆與序列分析

劉興彩，尹燕博，徐守振，李吉達(dá)，張 毅，郭妍妍

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193；3.青島澳蘭百特生物工程有限公司，山東 青島 266101）

豬巨細(xì)胞病毒（porcine cytomegalovirus，PCMV）屬于皰疹病毒科，β皰疹病毒亞科、巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）屬的成員；近來有人認(rèn)為將本病毒劃在玫瑰疹病毒屬中更為恰當(dāng)［1］。其gB蛋白是CMV重要跨膜糖蛋白，在病毒與機(jī)體細(xì)胞膜的粘附、融合及病毒進(jìn)入細(xì)胞和在細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移起作用［2］；gB蛋白具有較好的免疫原性［3］，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗CMV的特異性免疫應(yīng)答［4-5］。我們應(yīng)用PCR診斷方法對全國11個(gè)省市地區(qū)豬場的100份臨床樣品進(jìn)行了檢測［6］，篩選出4份PCR陽性病料，進(jìn)行了gB基因的克隆與序列分析，為PCMV的分類地位和進(jìn)化關(guān)系提供更多的信息。

1 材料與方法

1.1 病料 來自鄭州、福建、浙江金華和寧波病豬的肺臟。

1.2 菌株和載體 感受態(tài)細(xì)胞DH5α和pMD 18-T載體。

1.3 主要儀器和試劑 PCR擴(kuò)增儀（LongGene MG96G），瓊脂糖（美國Promega公司），Taq DNA聚合酶（5U／μL）、dNTPs（25μmol／L）為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)。

1.4 引物 根據(jù)GenBank發(fā)表的PCMV AF268041序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)了PCMV gB全基因引物 g1：5′-ATGACAGTGAGCAGTCGGAA-3′；g2：5′-TCACACGTCCTCGGTGGATAG-3′，并由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.5 DNA的提取 按照文獻(xiàn)［6］中的提取方法進(jìn)行提取。

1.6 gB基因PCR擴(kuò)增 取出已分裝有PCR反應(yīng)體系的離心管，加入2μL上述模板，混勻后稍離心，置PCR 儀中擴(kuò)增：95℃ 5 min，94℃ 30s，62℃30s，72℃2min，30個(gè)循環(huán)，72℃ 10min.取 PCR產(chǎn)物5μL在10g／L瓊脂糖凝膠上電泳，置凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.7 陽性克隆的鑒定與測序 回收PCR產(chǎn)物大小為2580bp，按照連接試劑盒說明書進(jìn)行連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，涂平板藍(lán)白斑篩選，將白色菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，置37℃劇烈震蕩培養(yǎng)12h后，進(jìn)行PCR鑒定，將陽性菌株送寶生物工程（大連）有限公司測序。

1.8 序列分析 應(yīng)用DNAStar軟件將測序結(jié)果與其他PCMV核苷酸和推測的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，與皰疹病毒各亞科gB糖蛋白進(jìn)行氨基酸序列分析，并與人皰疹病毒6型和7型（HHV-6和HHV-7）gB糖蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對，并構(gòu)建進(jìn)化樹；應(yīng)用在線分析軟件TMHMM，ProtParam，Cysteine Connectivity Prediction Server和Prosite分別對gB糖蛋白進(jìn)行跨膜預(yù)測，疏水性分析，半胱氨酸分析和潛在的N-糖基化位點(diǎn)分析。

2 結(jié)果

2.1 gB基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 從4個(gè)不同來源的PCMV PCR陽性病料中，用PCMV gB全基因的特異性引物分別擴(kuò)增出4個(gè)長度約為2580bp的條帶，與設(shè)計(jì)的長度一致（圖1）。

圖1 不同地區(qū)gB基因的PCR產(chǎn)物

2.2 PCMV gB基因序列同源性分析 對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行了PCMV gB基因序列測定，獲得4個(gè) PCMV gB 基 因 序 列 （NB200803，F(xiàn)J200809，JH200810和ZZ200811），序列分析發(fā)現(xiàn)他們的同源性在98.1%～99.6%，差異性在0.3%～2.0%，與其他PCMV gB基因序列同源性在96.1%～99.7%，差異性在0.3%～4.1%，結(jié)果如圖2。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，整個(gè)皰疹病毒屬明顯的分為3個(gè)亞科，而我們所獲得的來自4個(gè)不同地區(qū)的PCMV gB序列（圖中●所示）均屬于β皰疹病毒亞科，在β皰疹病毒亞科中，HHV-6和HHV-7與PCMV各株位于同一分支。另外，我們還發(fā)現(xiàn)PCMV推導(dǎo)的gB基因氨基酸序列出現(xiàn)分支，如圖3。

2.4 PCMV gB糖蛋白氨基酸序列與其他PCMV以及人皰疹病毒6型和7型gB糖蛋白氨基酸序列比較 推導(dǎo)的gB糖蛋白氨基酸序列有11個(gè)與二硫鍵形成有關(guān)的半胱氨酸（除NB200803在第320位：W→C和HN，湖南序列在第522位：C→Y），其中與HHV-6和HHV-7相比，共有9個(gè)潛在保守的半胱氨酸；潛在 N-糖基化位點(diǎn)（Asn-X-Ser or Thr）有17個(gè)，其中ZZ200811在196～198氨基酸處出現(xiàn)NNT→NYT，JH200810在563～565氨基酸處出現(xiàn)NNS→NDS以及ZZ200811、FJ200809、HN和55b（AF268040，Spain）在835～837氨基酸處出現(xiàn)NTT→NDS糖基化位點(diǎn)變異；在其氨基端包含一個(gè)疏水區(qū)（7～19），預(yù)測其為一個(gè)信號(hào)肽區(qū)域，應(yīng)用Prot Param分析蛋白的親水性，得到的親水性最大平均數(shù)均為負(fù)值，說明具有很強(qiáng)的疏水性，蛋白跨膜預(yù)測發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)序列（730～752），膜外區(qū)（1～729）和膜內(nèi)區(qū)（753～860），其跨膜區(qū)序列可能為跨膜錨定序列，與gB糖蛋白在膜上的錨定作用有關(guān)；潛在裂解位點(diǎn)是RYKR（439～442），無連續(xù)性堿性氨基酸插入，具有低致病性病毒分子特征。HHV-6和HHV-7的裂解位點(diǎn)分別是RRRR（396～399）和RKRR（393～396），它們均符合共有基序R-X-R／K-R規(guī)律。

從圖4可以很明顯的看出，黑色圓點(diǎn)比較密集有3個(gè)區(qū)域：第21～46位、第241～253位和第322～339位，這3個(gè)區(qū)域，變異比較集中，我們將其定為高變區(qū)。

3 討論

本試驗(yàn)對來自4個(gè)不同地區(qū)的PCMV PCR陽性病料gB基因進(jìn)行了克隆與序列分析，對推導(dǎo)的氨基酸進(jìn)行了半胱氨酸、潛在N-糖基化位點(diǎn)、裂解位點(diǎn)及疏水性和跨膜分析，發(fā)現(xiàn)gB基因所編碼的gB糖蛋白這些生物特性類似于其他皰疹病毒gB糖蛋白［7］。此外，發(fā)現(xiàn)在皰疹病毒屬中，PCMV gB基因序列與HHV-6和HHV-7的ORFs 36～40序列同源性最高，如圖3所示，包括我們測序的4個(gè)樣本在內(nèi)的PCMV毒株，與HHV-6和HHV-7同屬一個(gè)分支，說明它們之間具有較近的生物進(jìn)化關(guān)系，但兩者又處在不同的兩個(gè)群，說明兩者存在差異。有報(bào)道稱，由于它們的細(xì)胞嗜性和細(xì)胞內(nèi)DNA新陳代謝的顯著差異，而導(dǎo)致其生物進(jìn)化關(guān)系復(fù)雜而又矛盾［8-9］，PCMV與HHV-6和HHV-7具有許多相似的分子生物學(xué)特性，它們的不同之處可能源于宿主細(xì)胞的選擇壓力［10］。

序列分析表明，我們測得的4個(gè)PCMV gB基因序列同源性在98.1%～99.6%，差異性在0.3%～2.0%，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性在97.0%～99.3%，差異性在0.7%～3.1%，相對而言其序列變異不大。與其他PCMV gB基因序列同源性在96.1%～99.7%，差異性在0.3%～4.1%，差異性偏大的原因主要來源于湖南病料的PCMV gB基因序列。推導(dǎo)的氨基酸同源性在96.5%～99.7%，差異性在0.3%～3.1%，與β皰疹病毒亞科中其他常見病毒的同源性在25.9%～38.1%，由此說明CMV不同種屬間同源性較低。另外，我們發(fā)現(xiàn)在第21～46位這個(gè)高變區(qū)，HN（湖南）、ZZ200811、FJ200809和B6株（英國）的第33位由P→S，第42位由S→P，這說明它們之間發(fā)生了置換；第28位和29位由TA→ST，這是導(dǎo)致PCMV出現(xiàn)兩個(gè)分支的原因之一。該分支的出現(xiàn)說明其gB基因變異越來越明顯，并朝著兩個(gè)方向變異，而且該變異呈地域化發(fā)展的趨勢。

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