一株高產胞外多糖米酒乳桿菌的誘變篩選

白麗娟，季中梅，李向東

(1.遼寧醫學院食品科學與工程學院，遼寧錦州121001;2.光明乳業股份有限公司乳業研究院，乳業生物技術國家重點實驗室，上海200436)

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)產生的胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)是指由乳酸菌在生長過程中產生并分泌于胞外、常滲入培養基中的一種糖類化合物［1］。自20 世紀40 年代人們利用腸膜狀明串珠菌成功開發出右旋糖苷(dextran)以來，乳酸菌EPS 的研究與應用引起了更多學者的興趣。近些年來，其獨特的物理學和流變學特性以及公認的食用安全性，使其在食品和非食品工業倍受青睞。乳酸菌胞外多糖是天然的生物增稠劑，它可以替代其它目前正在應用的、來源于非食品級細菌的穩定劑或增稠劑，在發酵乳品、保健食品加工中具有重要的用途，因而在食品工業中具有廣闊的市場前景［2］。然而，乳酸菌胞外多糖的產量一般來說都比較低(50～425mg/L)，因此其應用也受到一定的限制。提高胞外多糖產量的研究，目前備受關注［3-4］。朱奇等選用1 株酸乳生產菌——嗜熱乳鏈球菌為出發菌株，采用紫外線和硫酸二乙酯進行復合誘變，得到EPS 產量高達965mg/L 的突變株，且具有良好的遺傳穩定性［5］。本文通過對高產胞外多糖的米酒乳桿菌進行誘變篩選，試圖獲得誘變的優良菌株，提高胞外多糖的產量，為以后工業生產使用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米酒乳桿菌BXR - 5 - 3、保加利亞乳桿菌JCM1002、嗜熱鏈球菌IFO13597 由遼寧醫學院實驗室提供;MRS 液體和固體培養基、脫脂乳培養基、TPY 液體培養基 按文獻［6 -7］配制;蒽酮 上?；缮镉邢薰?無水葡萄糖、硫酸、K2HPO4、檸檬酸二銨、MnSO4·4H2O、醋酸鈉 均為分析純，濟南全旺化工有限公司。

ZKSJ-1000 型超凈工作臺 深圳市中科圣杰凈化設備有限公司;DHP-9082 型恒溫培養箱 上海壘固儀器有限公司;722 分光光度計 上海分析儀器廠;LGJ-10D 型真空冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司;HH-1 型電子恒溫水浴鍋 上海醫療器械五廠;KX-99 型干燥箱 重慶實驗設備廠一分廠;XL-90 型低溫超速離心機 美國Beckman。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的制備 將實驗室保存的菌株，接種到經滅菌的11.5%脫脂乳培養基中，37℃培養至凝乳，接種凝乳2% 于MRS 等合成培養基中，37℃培養24～26h，4℃冰箱中保存備用。

1.2.2 葡萄糖標準曲線的制備 取0.1g/L 的葡萄糖溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80mL，用蒸餾水補至1.00mL，分別加入4.00mL 蒽酮試劑，迅速浸于冰水中冷卻，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加蓋玻璃球，以防蒸發。自水浴重新煮沸起，準確煮沸10min 取出，用自來水冷卻，室溫放置10min 左右，于620nm 比色，以同樣處理重蒸水為空白，進行比色。以葡萄糖每毫升含微克數為橫坐標，縱坐標為光密度值，繪制葡萄糖標準曲線，建立回歸方程，求胞外多糖含量。

1.2.3 不同紫外線照射距離和時間對乳酸菌誘變后胞外多糖產量的影響 將對數生長后期的出發菌培養液離心，用無菌生理鹽水將沉淀菌體稀釋成108cfu/mL，用直徑9cm 的平皿蓋裝菌液10mL，垂直置于15W 紫外線燈管下，分別選擇照射距離為10、15、20、25、30cm 照射1、5、10、15、20min，經初篩，復篩，利用蒽酮-硫酸法測得多糖含量，選出高產胞外多糖的優良菌株，并確定不同照射時間時的最佳照射距離。

1.2.4 不同濃度亞硝基胍對乳酸菌誘變后多糖產量的影響 分別選擇亞硝基胍濃度為100、200、300、400、500μg/mL 對米酒乳桿菌BXR-5-3 進行誘變，經初篩，復篩，利用蒽酮-硫酸法測得多糖含量，選出高產胞外多糖的優良菌株，并確定亞硝基胍的最佳濃度。

1.2.5 紫外線、亞硝基胍復合誘變對多糖產量的影響以1.2.3 和1.2.4 的實驗結果為基礎，選擇紫外線照射距離、亞硝基胍的濃度以及處理時間為主要影響因素進行L9(34)正交實驗。實驗設計如表1 所示。

表1 因素水平表Table 1 The table of factors and levels

1.3 誘變菌株的篩選

將誘變后的菌液用MRS 瓊脂平板避光培養，挑選20 個菌落較大、與出發菌株的菌落有一定差異性的菌落進行純培養，用MRS 瓊脂斜面保存。

1.3.1 高產胞外多糖米酒乳桿菌的初篩 取上述挑選出的菌落活化并取1mL 接入50mL MRS 液體培養基培養24h 后經分離純化胞外多糖后，以葡萄糖為參照標準繪制標準曲線，采用硫酸-蒽酮法測定多糖含量［8］。

1.3.2 高產胞外多糖的米酒乳桿菌的復篩 將初步篩選符合要求的菌株接種到50mL MRS 液體培養基中37℃培養24h，將培養液4℃、12000 ×g 冷凍離心30min，取上清液棄去菌體沉淀。按照1∶3 的料液比，95%酒精濃度(vol)，4℃條件下沉淀24h，上清液再次4℃、12000 ×g 冷凍離心30min，將離心得到的沉淀和酒精沉淀歸并，利用蒸餾水復溶［9］，透析24h，取出透析液定容至20mL。利用蒽酮-硫酸顯色法計算各誘變菌種所產生的多糖含量，找到多糖產量比較高的米酒乳桿菌誘變菌株。

1.4 分析方法

菌落培養及保存用MRS 瓊脂培養基;光密度采用722 分光光度計測定;pH 用酸度計測定;總糖含量采用硫酸-蒽酮法測定，以葡萄糖作為標準［10］。

2 結果與分析

2.1 不同紫外線照射距離和照射時間對乳酸菌誘變后胞外多糖產量的影響

選擇照射距離為10、15、20、25、30cm 分別照射1、5、10、15、20min 后，經初篩，復篩，利用蒽酮-硫酸法測得多糖含量如圖1 所示。在距離為25cm 時照射10min 篩選到一株誘變菌株胞外多糖產量最高為305.2mg/L，其次是距離為20cm 時分別照射5min 和20min 篩選到兩株誘變菌株產量為289.5mg/L 和285.8mg/L。而在距離為15cm 時照射15min 篩選到的菌株產量最高為198.7mg/L，照射距離為10cm 和30cm 時菌株產量都非常低。

圖1 不同紫外線照射距離和照射時間誘變菌株胞外多糖的產量(n=3)Fig.1 Yield of exopolysaccharide in different distance and time of ultraviolet ray(n=3)

2.2 亞硝基胍的濃度對胞外多糖產量的影響

分別選擇亞硝基胍濃度為100、200、300、400、500μg/mL 對米酒乳桿菌BXR-5-3 進行誘變，經初篩，復篩，利用蒽酮-硫酸法測得多糖含量如圖2 所示，隨著亞硝基胍濃度的增加，米酒乳桿菌變異菌株的胞外多糖產量也隨之增多，當亞硝基胍濃度達到300μg/mL 時，篩選出一株胞外多糖產量達到最高的菌株，多糖產量為322.7mg/L，隨后誘變菌株胞外多糖產量開始下降。

圖2 亞硝基胍的濃度對胞外多糖產量的影響(n=3)Fig.2 Effect of nitrosoguanidine concentration on yield of exopolysaccharide(n=3)

2.3 高產胞外多糖米酒乳桿菌的最佳誘變條件的選擇

以2.1 和2.2 的實驗結果為基礎，選擇紫外線照射距離、照射時間以及亞硝基胍的濃度為主要影響因素進行L9(34)正交實驗。實驗結果如表2 所示。

表2 紫外線、亞硝基胍復合誘變正交實驗結果Table 2 Result of orthogonal test to mutagenesis by ultraviolet ray-nitrosoguanidine

從表2 極差R 值可以看出，因素的主次關系為:B ＞C ＞A，其中亞硝基胍濃度對米酒乳桿菌胞外多糖的產量影響最為明顯，其次是處理時間和紫外線照射距離。正交實驗結果確定米酒乳桿菌產胞外多糖的最佳誘變條件組合為A2B2C3，即誘變劑量為300μg/mL，紫外線照射距離20cm，處理時間為20min，此時米酒乳桿菌胞外多糖產量最高為339.0mg/mL。

3 結論

3.1 經紫外線照射，通過改變照射距離和處理時間，在照射距離為25cm，處理時間為10min 時，經初篩，復篩等操作后得到一株符合要求的高產胞外多糖的誘變菌株，此菌株胞外多糖的產量為305.2mg/L。

3.2 經亞硝基胍處理，通過改變亞硝基胍溶液的濃度，比較幾組濃度處理后乳酸菌的胞外多糖產量的情況，在濃度為300μg/mL 的亞硝基胍誘變后，得到一株符合要求的高產胞外多糖誘變菌株，此菌株的胞外多糖產量為322.7mg/L。

3.3 經紫外線-亞硝基胍對米酒乳桿菌進行復合誘變，在誘變條件為紫外線照射距離為20cm，亞硝基胍的濃度為300μg/mL，處理時間為20min 得到一株符合要求的米酒乳桿菌誘變菌株，此時胞外多糖的產量為339mg/L。

經實驗可知紫外線和亞硝基胍分別誘變后對米酒乳桿菌胞外多糖的產量均有很大影響，尤其是紫外線和亞硝基胍復合誘變后獲得胞外多糖產量比紫外線和亞硝基胍單獨誘變稍高，并且不同誘變劑量與不同處理時間組合誘變的菌株也差別很大。

4 討論

已知出發菌株米酒乳桿菌BXR-5-3 在最適條件下最大合成量為78.86mg/L［6］，經過紫外線和亞硝基胍復合誘變后所得菌株胞外多糖最大產量為339.0mg/L，是原菌株產量的4 倍多，雖然產量提高很明顯，但是還不能滿足工業化生產的需要，可為日后的工業化生產和滿足人們對于胞外多糖日益增長的需求奠定堅實的基礎。近年來，隨著生物工程技術的發展，基因工程技術已應用到菌種的改造方面，使育種工作朝著更快捷、更高效的方向發展，胞外多糖高產菌株的分子育種研究有待進一步開展。

［1］鐘顏麟，彭志英，趙謀明.乳酸菌胞外多糖的研究［J］.中國乳品工業，1999(4):7-9.

［2］鄧凱波.乳酸菌胞外多糖的功能及在食品工業中的應用［J］.食品安全導刊，2009(7):49-50.

［3］李盛鈺，曾憲鵬，楊貞耐.提高乳酸菌胞外多糖產量的途徑［J］.食品與生物技術學報，2009(3):1-5.

［4］劉先，康小紅，齡南.乳酸菌發酵產生胞外多糖的研究進展［J］.中國乳業，2010(2):127-130.

［5］朱奇，郭善利，陳彥，等.酸乳中胞外多糖(EPS)產生條件的研究［J］.食品科技，2004(4):18-19.

［6］陳天壽，微生物培養基的制造與應用［M］.北京:中國農業出版社，1995.

［7］白麗娟，殷文正，李向東.米酒乳桿菌胞外多糖BXR-5-3生物合成條件的研究［J］.微生物學雜志，2008，28(1):49-53.

［8］劉齊，劉愛紅，孫美玲，等.嗜酸乳桿菌胞外多糖提取工藝優化［J］.食品與發酵工業，2011(2):52-56.

［9］劉齊.高產胞外多糖的嗜酸乳桿菌誘變篩選［J］.中國釀造，2010(6):103-105.

［10］S A Kimmel，R F Roberts，G R Ziegler.Optimization of exopolysaccharide production by L. delbrueckiisubsp bulgaricus RR grown in a semidefined medium［J］. Micro，1998，64:659-664.