高溫紫鏈霉菌酸性耐熱幾丁質酶的純化及性質研究

楊紹青，張舒平，閆巧娟，劉竹青，江正強，*

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083;2.中國農業大學工學院，北京100083;3.中國農業大學水利與土木工程學院，北京100083)

幾丁質酶(EC3.2.1.14)是一類重要的糖苷鍵水解酶，能夠催化幾丁質水解產生N-乙酰氨基葡萄糖單體或低分子量幾丁寡糖［1］。近年來，幾丁質酶由于在制備幾丁寡糖、處理海洋廢棄物以及農業生物防治等方面具有巨大的應用潛力而備受關注。目前幾丁質酶已被廣泛應用于醫藥、食品、化妝品、飼料、環保以及能源等領域。幾丁質酶廣泛存在于細菌、鏈霉菌、真菌、植物、昆蟲甚至脊椎動物中［1-2］。微生物來源的幾丁質酶由于具有生產速度快、產量高、性能穩定等優點，目前已成為幾丁質酶的主要來源。迄今，已有許多關于不同微生物來源幾丁質酶的純化及性質的研究報道，其中以鏈霉菌來源為主，主要有灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)、深藍紫鏈霉菌(Streptomyces cyaneus)、弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)、委內瑞拉鏈霉菌(Streptomyces venezuelae)、天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)、紅色鏈霉菌(Streptomyces erythraeus ) 以 及 紫 黑 鏈 霉 菌(Streptomyces violaceusniger)等［2-4］。耐熱幾丁質酶具有熱穩定性好、可在高溫下反應從而加快反應速度、高溫條件可減少環境微生物污染等優點，因此，相較中溫酶而言更適合于工業化生產和應用。目前關于嗜熱菌耐熱幾丁質酶的研究主要集中于部分嗜熱古菌、嗜熱細菌及嗜熱真菌［5-6］，關于嗜熱鏈霉菌耐熱幾丁質酶的研究報道相對較少。Tsujibo 等［7］從高溫紫鏈霉菌OPC-520 發酵液中純化得到一種分子量為40ku 的幾丁質酶，最適溫度和pH 分別為80℃和9.0。Christodoulou 等［8］進一步克隆了高溫紫鏈霉菌OPC-520 的幾丁質酶基因chit40，并進行了高效表達，得到分子量為40ku 的重組幾丁質酶，該酶的最適溫度和pH 分別為60℃和6.0。目前，還沒有關于高溫紫鏈霉菌酸性幾丁質酶純化和性質的研究報道。實驗室前期從土壤樣品中篩選得到一株能夠產耐熱幾丁質酶的嗜熱鏈霉菌Z16，鑒定其為高溫紫鏈霉菌。本研究進一步對該菌所產耐熱幾丁質酶進行分離純化，并研究其酶學性質及對膠體幾丁質的水解特性，為其今后工業化生產和應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

離子交換層析柱料DEAE-52、凝膠層析柱料Superdex-75 GE Healthcare 公司;幾丁質、羧甲基纖維素(CMC) 美國Sigma 公司;乙二醇殼聚糖、乙二醇幾丁質 日本Wako 公司;幾丁寡糖 中科院微生物所金城教授;低分子量標準蛋白 大連寶生物工程有限公司;其它試劑 若無特殊說明均為分析純。

TU-1800PC 紫外可見分光光度計 北京普析通用有限公司;蛋白純化系統 上海青浦滬西儀器廠;硅膠板60F254德國Merck 公司;GL-20B 冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 菌株及發酵產酶

菌株:高溫紫鏈霉菌Z16 由實驗室篩選并保存。菌株在膠體幾丁質平板上50℃培養3～4d 后保存于4℃條件下，每6～7 周轉接1 次。平板培養基組成為(g/L):膠體幾丁質5，(NH4)2SO42，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO40.3，KH2PO40.7，FeSO40.1，瓊脂15，pH值自然。

發酵產酶:首先將1 ～2 環菌種由平板接入到50mL 種 子 培 養 基 中(250mL 三 角 瓶)，50℃，200r/min振蕩培養18h，即為發酵種子液。然后按5%的接種量接種種子液于發酵培養基中，45℃，200r/min 振蕩培養60h。發酵液于4℃下9720 ×g 離心10min，上清液即為幾丁質酶粗酶液。

種子培養基組成為(g/L):粉末幾丁質10，酵母浸粉5，蛋白胨5，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO40.3，KH2PO40.7，FeSO40.01 和ZnSO40.01，pH 自然。發酵培養基組成為(g/L):膠體幾丁質5，粉末幾丁質10，酵母浸粉1.25，黃豆粉3.75，吐溫20 4，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO40.3，KH2PO40.7，FeSO40.01 和ZnSO40.01，pH 自然。

1.3 酶活力及蛋白含量測定

采用DNS 法測定幾丁質酶酶活力。取100μL 膠體幾丁質溶液(1%)于1.5mL 離心管中，50℃水浴預熱10min，然后向離心管中加入100μL 適當稀釋的酶液。50℃反應30min 后加入300μLDNS 試劑終止反應，最后煮沸10min 顯色。待反應體系溶液冷卻至室溫后加入250μL 的去離子水，9720 ×g 離心5min，取上清液于540nm 下測吸光度值。酶活力單位(U)定義為:在上述反應條件下每分鐘釋放1μmol N-乙酰氨基葡萄糖所需要的酶量，以N-乙酰氨基葡萄糖為標準。

蛋白含量的測定采用Lowry 法［9］，以牛血清蛋白作為標準。

1.4 幾丁質酶的純化

首先向粗酶液中緩慢加入40%～80%飽和度的硫酸銨，酶液在4℃下緩慢攪拌30min 后于9720 ×g下冷凍離心10min，收集沉淀，用20mmol/L pH7.0 的磷酸緩沖液溶解沉淀，沉淀溶液在相同的緩沖液中4℃下透析過夜。然后將透析后的蛋白樣品以1mL/min的流速上樣到預先用20mmol/L 磷酸緩沖液(pH7.0)平衡好的DEAE-52 陰離子交換層析柱中。先用平衡緩沖液以相同的流速洗脫未結合的雜蛋白直至OD280小于0.05，接著用0.5 ～1.0mol/L 梯度的NaCl 溶液(用pH7.0，20mmol/L PB 緩沖液配制)線性洗脫，收集洗脫部分，測定酶活力，SDS-PAGE 檢測酶純度。

1.5 SDS-PAGE 及分子量測定

SDS-PAGE 按Laemmli 等［10］方法進行，分離膠濃度為12.5%(w/v)，濃縮膠濃度為4.5%(w/v)?？捡R斯亮藍R-250 染色顯示蛋白帶。依據標準蛋白及待測純酶在SDS 凝膠上的相對遷移率來計算純酶在變性條件下的分子量。幾丁質酶活性狀態下分子量采用凝膠過濾法測定:將純酶樣品和標準蛋白分別以相同的條件過Superdex-75(1.0cm ×40cm)凝膠柱。采用20mmol/L 檸檬酸緩沖溶液(pH6.0)為洗脫液，洗脫流速0.33mL/min。

1.6 幾丁質酶的最適pH 與最適溫度及pH 與溫度穩定性

在不同的pH 條件下測定酶活力以確定酶的最適反應pH。不同緩沖液體系分別為50mmol/L 檸檬酸緩沖溶液(pH3.0 ～6.0)、乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH4.0～6.0)、MES 緩沖液(pH5.5～6.5)、磷酸緩沖溶液(pH6.0～8.0)、CHES(pH8.0～10.0)、CAPS (pH10.0～11.0)和Na2HPO4-NaOH 緩沖液(pH11.0 ～12.0)。幾丁質酶的pH 穩定性測定:將酶液在上述不同緩沖液中50℃下處理30min 后按照標準的方法測定殘余酶活力。

幾丁質酶的最適溫度測定:分別在30～90℃下測定酶活力，酶活力最高點即為幾丁質酶的最適反應溫度。溫度穩定性:將純酶分別在30 ～90℃下保溫30min，然后在50℃下測定殘余酶活，以未保溫(稀釋相同倍數后，4℃處理)的酶活力作為100%。幾丁質酶的半衰期測定:將酶液在55、60、65、70℃下分別保溫300min，間隔取樣，測定殘余酶活力，以ln(相對殘余酶活力)與處理時間作圖，然后計算半衰期。

1.7 幾丁質酶的底物特異性

分別以1% (w/v)的膠體幾丁質、乙二醇幾丁質、殼聚糖溶液、乙二醇殼聚糖、CMC、樺木木聚糖、刺槐豆膠、海帶多糖及可溶性淀粉(溶解于50mmol/L pH4.0 緩沖液中)作為反應底物，50℃下分別反應10min 測定幾丁質酶的酶活力。

1.8 幾丁質酶的水解特性及產物分析

在1%的膠體幾丁質溶液中加入1U/mL 的幾丁質酶，混勻后置于50℃水浴中反應，在不同的時間點取樣，樣品于沸水中滅活5min 后采用TLC 法分析水解產物。展層體系為正丁醇∶乙酸∶水=2∶1∶1(v∶v∶v)。顯色參考Kopparapu 等［11］的方法進行。

2 結果與分析

2.1 幾丁質酶的分離純化

高溫紫鏈霉菌Z16 發酵產幾丁質酶的粗酶液經硫酸銨分級沉淀和DEAE-52 弱陰離子交換層析兩步純化后得到電泳級純酶(圖1)。純化過程酶活力回收率為22.3%，純化倍數為12.7，比酶活力由2.9U/mg 提高到36.8U/mg(表1)。SDS-PAGE 法和凝膠過濾法測測定幾丁質酶的分子量分別為41.6ku(圖1)和40.8ku，說明該幾丁質酶為單亞基蛋白。

表1 高溫紫鏈霉菌Z16 幾丁質酶的純化Table 1 Purification of the a chitinase from the culture broth of S.thermoviolaceus Z16

不同微生物來源的幾丁質酶分子量差異較大，大多處于20～120ku 之間［12］。通常，細菌來源的幾丁質酶分子量較大(60～110ku)，真菌幾丁質酶分子量相對較小(30～60ku)，而放線菌來源的幾丁質酶一般在30～40ku 左右［13］。本研究中的幾丁質酶分子量與來源于高溫紫鏈霉菌OPC-520［7］和淺玫瑰色鏈霉菌GH-18 的40ku 幾丁質酶較為接近［14］，但高于其它鏈霉菌如Streptomyces sp.M-20、Streptomyces sp. DA11和Streptomyces anulatus 等［3-4，15］幾丁質酶的分子量。

圖1 高溫紫鏈霉菌Z16 幾丁質酶的純化電泳圖Fig.1 SDS-PAGE analysis of the proteins during the purification process of a chitinase from S.thermoviolaceus Z16

2.2 幾丁質酶的最適pH 及pH 穩定性

在不同的pH 條件下測定幾丁質酶的酶活力，結果表明該酶的最適反應pH 為pH4.0(檸檬酸緩沖液)，在處于pH3.0～6.0 的酸性條件下保持較高的酶活力，當pH ＞6.0 時，酶活力開始快速下降(圖2A)，說明該酶是一種酸性幾丁質酶。該幾丁質酶酶在pH3.0～11.5 的不同緩沖液中處理30min 后殘余酶活力仍保存在80%以上(圖2B)，說明該酶具有很強的pH 穩定性和很寬的pH 穩定范圍。

圖2 幾丁質酶的最適反應pH (A)及pH 穩定性(B)Fig.2 Optimal pH(A)and pH stability(B)of the purified chitinase

雖然微生物幾丁質酶的最適pH 差別較大，分布于3.0 至11.0 之間，但絕大多數放線菌幾丁質酶的最適pH 都處于偏酸性環境(pH4.0～6.0)。高溫紫鏈霉菌Z16 幾丁質酶的最適pH 為4.0，與來源于其它鏈霉菌的幾丁質酶最適pH 接近，如來源于Strptomyces coelicolor A3 的幾丁質酶(pH4.0)［16］，但明顯比同一種屬菌株高溫紫鏈霉菌OPC-520 來源的幾丁質酶的最適pH9.0 低［17］，說明兩者性質存在很大差別，并不是同一種幾丁質酶。

2.3 幾丁質酶的最適溫度及溫度穩定性

幾丁質酶的最適反應溫度為60℃(圖3A)，當溫度處于50～70℃之間時，幾丁質酶具有較高的酶活力(＞60%)，而當溫度低于50℃或高于70℃時，酶活力迅速下降(圖3A)。溫度穩定性測定結果表明該幾丁質酶具有很好的溫度穩定性，60℃下保溫30min 后殘余酶活力仍保持在80%以上(圖3B)，當溫度繼續升高到65℃以上時，殘余酶活力開始急劇下降至25%以下(圖3B)。進一步測定該酶在不同溫度下的半衰期，結果表明該酶在55℃和60℃時具有很好的溫度穩定性，半衰期分別為267min 和132.9min(圖3C)，而當溫度提高至65℃和70℃時，該酶的半衰期快速降至16.6min 和13.4min(圖3C)。

通常，高溫酶相較于中溫酶來說具有許多獨特的優勢，如不易變性、便于儲藏、反應速度快、效率高、不易受污染等，因此實際應用的適應性更強。高溫紫鏈霉菌Z16 幾丁質酶的最適溫度為60℃，比Tsujibo 等［17］報道的高溫紫鏈霉菌來源的幾丁質酶最適溫度低(80℃)，與來自高溫紫鏈霉菌OPC-520 野生型幾丁質酶一致(60℃)［8］，但明顯高于其它鏈霉菌來源的幾丁質酶，如紫黑鏈霉菌(28℃)［18］、中溫鏈霉菌RC1071(40℃)［19］、海洋鏈霉菌DA11(40℃)［4］和灰色鏈霉菌HUT7037(55℃)［2］等。

2.4 幾丁質酶的底物特異性及水解特性

圖3 幾丁質酶的最適反應溫度(A)、穩定穩定性(B)和半衰期(C)Fig.3 Optimal temperature (A)，thermostablity (B)and thermal denaturing time (C)of a chitinase from S.thermoviolaceus Z16

幾丁質酶的底物特異性見表2。該酶具有嚴格的底物特異性，對膠體幾丁質表現出了最強的水解作用，比酶活力達到36.8U/mg，對乙二醇幾丁質、CMC 及殼聚糖溶液只有輕微的水解能力，比酶活力分別僅為3.0、0.6、0.32U/mg，而對乙二醇殼聚糖、刺槐豆膠、海帶多糖、樺木木聚糖和可溶性淀粉等其它底物沒有水解能力。

表2 幾丁質酶的底物特異性Table 2 Substrate specificity of the purified chitinase

在1%濃度的膠體幾丁質溶液中加入1U/mL 的幾丁質酶，50℃進行水解反應以考察幾丁質酶對膠體幾丁質的水解特性。結果表明該幾丁質酶能夠高效降解膠體幾丁質，降解產物主要為N-乙酰氨基葡萄糖和幾丁二糖，其次還有少量的幾丁三糖生成(圖4)。根據該酶水解產物的組成，可判定其為內切幾丁質酶。本研究中的幾丁質酶顯示出嚴格的底物特異性，僅對膠體幾丁質溶液有很強的水解活性，對乙二醇幾丁質、CMC 及殼聚糖溶液只有輕微的水解能力，而對其它底物則沒有水解能力。這一特性與來源于Streptomyces sp.M-20 的幾丁質酶比較接近［3］，但是與灰色鏈霉菌HUT7037 來源的幾丁質酶差別較大，后者具有較寬的底物特異性范圍，不僅能夠水解膠體幾丁質，而且還能夠水解乙二醇幾丁質、羧甲基幾丁質以及脫乙酰幾丁質等幾丁質類化合物［2］。嚴格的底物特異性使本研究中的酸性耐熱幾丁質酶適合應用于幾丁質資源的高效降解、生物轉化等領域。

3 結論

從高溫紫鏈霉菌Z16 發酵液中純化得到一種幾丁質酶。該酶為單亞基蛋白，SDS-PAGE 和凝膠過濾測得分子量分別為41.6ku 和40.8ku。該酶的最適反應pH 和最適反應溫度分別為pH4.0 和60℃，且該酶在pH3.0～6.0 時保持較高的酶活力，同時，該酶在55℃和60℃的半衰期分別為267min 和132.9min，表明該酶為一種酸性的耐熱酶。該酶能夠將膠體幾丁質水解成N-乙酰氨基葡萄糖、幾丁二糖以和少量的幾丁三糖。高溫紫鏈霉菌Z16 這些優良的酶學特性使其具有重要的應用價值和廣闊的應用前景。

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