HPLC 法測定人血漿中5-氟尿嘧啶的濃度

葉麗卡，謝志紅，陳瑞卿（廣州醫學院第二附屬醫院，廣州 510260）

5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）是尿嘧啶的類似物，可以使合成脫氧核糖核酸（DNA）的胸腺嘧啶合成酶失活，也可直接替代尿嘧啶摻入核糖核酸（RNA），導致致死合成。因此，在消化道、頭頸部腫瘤等多種惡性腫瘤的治療中，5-FU是最常用的基礎藥物[1，2]。5-FU在體內代謝半衰期短、毒副反應大，且吸收不規則、個體消除呈非線性，若體內濃度過高時會發生典型的毒副反應如胃腸道毒性和骨髓抑制，還會在生長迅速的正常組織中產生一些毒性作用，包括中樞系統（如小腦變性、共濟失調、嗜睡）、心血管系統及皮膚（如手足綜合征、感覺遲鈍）等毒性作用。因此，有必要建立測定人體血漿5-FU濃度水平的方法用于藥動學以及相關研究。眾多文獻報道用高效液相色譜（HPLC）法成功測定5-FU前體類藥物在肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、直腸癌的癌組織、血液、正常組織中不同時間點的濃度變化[3～6]，但方法往往檢測限過高或者難以重復。本試驗旨在建立一種快速、靈敏、準確的測定人體血漿內5-FU血藥濃度的方法，為下一步研究該藥在我國人群的藥動學打下基礎。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜系統，包括LC-10ATVP雙泵、SPD-M10AVP可變波長紫外檢測器、CTO-10AVP柱溫箱、SIL-10ADVP自動進樣器、CBM-10A系統控制器、DGU-12A脫氣裝置、LC solution工作站（日本島津公司）；XW-80渦旋混合器（上海醫科大學儀器廠）；B160A型醫用低速離心機（河北白洋離心機廠）；5417R小型臺式高速離心機（德國Eppendorf公司）；真空離心濃縮儀（美國Thermo公司）。

1.2 試藥

5-FU對照品（美國Sigma公司，批號：097K1352，純度：99%）；其余試劑均為分析純；所用超純水為自制去離子水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate C18色譜柱（250mm×4.5mm，5μm）；流動相：10mmol·L－1KH2PO4溶液；流速：1.0m L·min－1；檢測波長：265 nm；柱溫：40℃；進樣量：20μL。

2.2 對照品溶液配制

準確稱取5-FU對照品30.7mg至25m L量瓶，加入1m L鹽酸，最后用蒸餾水定容至刻度，得到1.228mg·m L－1的5-FU對照品溶液。

2.3 血漿樣品處理方法

取血漿100μL，置于5m L玻璃試管中，加入乙酸乙酯2 m L，渦旋振蕩2min后，3 200 r·min－1離心5min，取上層析液置于另一玻璃試管中；再次加入乙酸乙酯2m L進行第2次提取，渦旋振蕩2min后，3 200 r·min－1離心5min，取上層析液。合并2次提取的上層析液，離心濃縮揮干，加入100μL流動相，混勻取出，置于EP管中，10 000 r·min－1離心7min，取上清液20μL進樣。

2.4 專屬性考察

將取空白血漿200μL按“2.3”項下方法操作，取上清液20 μL進樣分析，得到空白血漿色譜圖，判斷空白血漿的干擾情況；取5-FU對照品20μL進樣分析，得到5-FU對照品色譜圖，判斷5-FU在本文方法條件下出峰情況；將空白血漿和5-FU對照品混合，按“2.3”項下方法操作，取上清液20μL進樣分析，得血漿+5-FU對照品色譜圖。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.5-FU對照品；B.空白血漿+5-FU對照品；C.空白血漿；1.5-FUFig 1 HPLC chromatogram sA.5-FU control；B.blank plasma+5-FU control；C.blank plasma；1.5-FU

2.5 線性關系考察

取空白血漿8份，分別加入由5-FU對照品和蒸餾水配制的系列標準液適量并混勻，使血漿中藥物濃度分別為0.48、0.96、1.92、3.84、7.68、15.35、30.7、61.4μg·m L－1，按“2.3”項下方法處理，最后分別取20μL進樣，經HPLC法分析，得到5-FU各濃度峰面積（A）。以峰面積（A）對相應濃度（c）進行回歸分析，得到5-FU的回歸方程為A＝0.542 2c－0.091 8（r＝0.999 8，n＝8）。結果表明，5-FU血藥濃度在0.48～61.4μg·m L－1范圍內線性關系良好。

2.6 精密度及回收率試驗

配制5-FU低、中、高（1.92、7.68、30.7μg·m L－1）3種不同濃度的含藥標準血漿，按“2.3”項下方法處理，每個濃度進行5樣本分析，于同日內和連續3 d內分別處理測定。將測得的峰面積代入標準曲線，得相應濃度，計算RSD；與理論濃度相比，求得方法回收率，詳見表1。

表1 精密度及方法回收率試驗結果（n＝5）Tab 1 Resultsof precision andmethodology recovery tests

2.7 樣品穩定性試驗

配制含5-FU 1.92、7.68、30.1mg·L－1的3組共15個樣品，分別考察室溫放置（1、2、3 d）穩定性、長期凍存（－20℃凍存10、20、30 d）以及凍融穩定性（凍融1、2、3次），按“2.3”項下方法分別進行操作及測定，結果其RSD均＜10%。

2.8 樣品質量控制試驗

分別配制成低、中、高濃度（1.92、7.68、30.1mg·L－1）的血漿樣品各12份，置－20℃凍存備用。每次檢測血樣時同時檢測3種質量濃度質控樣品，如果相對回收率落在85%～115%之間，即可認為檢測正常，否則須檢查整個操作過程以及儀器原因。在本試驗中，檢測的質控樣品均在規定范圍內，則可認為儀器處于正常狀態。

3 討論

5-FU水溶性很大，在本研究建立的方法中，筆者用純磷酸鹽作為流動相，流動相中不含有機溶劑，容易長菌變質，因此，要注意即時沖洗管道，以免造成污染和堵塞；同時，應注意選用適用于水溶性物質的色譜柱，以免出現色譜柱壽命過短而造成損失和延誤試驗進程。

因為5-FU為水溶性較強的物質，因此，在部分文獻中，采用了蛋白沉淀法處理血漿樣品。本研究中筆者發現，若用高氯酸、乙腈、甲醇等沉淀蛋白，在5-FU出峰時間均存在干擾，無法消除或與待測物質分離；另外，蛋白沉淀法往往稀釋了藥物濃度，而5-FU在血漿中濃度較低，因此，用有機溶劑提取后濃縮更利于提高檢測靈敏度。筆者曾嘗試用二氯甲烷、異丙醇、氯仿、乙酸乙酯等作為提取溶劑，經比較，乙酸乙酯作為提取溶劑時，提取率最好、干擾少。因此，選用乙酸乙酯作提取溶劑。

經過方法學驗證，該方法符合生物樣本測定的要求，與文獻報道的5-FU測定方法相比，整個試驗過程中所用試劑成本低，適合大樣本研究中血漿中5-FU濃度的測定。該方法具有操作簡便可靠、準確、穩定性高等特點，適用于人血漿中5-FU的濃度測定。該方法的建立可以為5-FU的人體藥動學相關研究提供參考。

[1]黎遠冬，梁寧生，韋勁松，等.HPLC法同時測定人血漿中5-氟尿嘧啶及其活性代謝物5-氟-2脫氧尿嘧啶核苷的濃度[J].藥物分析雜志，2007，27（4）：494.

[2]劉傳華，劉師蓮，卞繼峰，等.HPLC快速測定5-氟尿嘧啶血藥濃度[J].藥物分析雜志，2002，22（2）：96.

[3]陸基宗，溫 浩，許英華，等.肝癌患者5-氟尿嘧啶血藥濃度的監測與測定方法的改進[J].中國醫院藥學雜志，2004，24（2）：83.

[4]姚水寶，楊水新.高效液相色譜法測定人血清中5-氟尿嘧啶的濃度[J].中國藥房，2001，12（4）：227.

[5]Licea-Perez H，Wang S，Bowen C.Developmentof a sensitive and selective LC-MS/MSmethod for the determination of alpha-fluoro-beta-alanine，5-fluorouracil and capecitabine in human plasma[J].JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2009，877（11）：1 040.

[6]Kosovec JE，Egorin MJ，Gjurich S，et al.Quantitation of 5-fluorouracil（5-FU）in human plasma by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom，2008，22（2）：224.