東北原生種獼猴桃黃酮類化合物的提取研究

么宏偉，張躍新，謝晨陽，吳洪軍，馮磊，趙鳳臣，張學(xué)義

（黑龍江省林副特產(chǎn)研究所，黑龍江省非木質(zhì)林產(chǎn)品研發(fā)重點實驗室，黑龍江 牡丹江 157011）

獼猴桃屬于獼猴桃科獼猴桃屬的落葉藤本植物，經(jīng)濟價值較高。我國原產(chǎn)52個種、變種和變型，有經(jīng)濟價值的有9種［1］。東北原生種獼猴桃包括軟棗獼猴桃［Actinidia arguta（Sieb.et Zucc.）Planch.］、狗棗獼猴桃［A.kolomikta（Rupr.etMaxim.）Planch.］和葛棗獼猴桃［A.polygama（Sieb.et Zucc.）Miq.］，它們是獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）落葉藤本植物，是3種有經(jīng)濟價值的種類。東北原生種獼猴桃作為一種純天然、綠色、野生的可食用漿果，具有抗發(fā)炎、抗病毒、抗氧化、抗癌以及舒張血管等作用，其主要活性成分之一就是黃酮類化合物。

本文主要從以下幾方面對東北原生種獼猴桃黃酮類化合物的提取進行研究：（1）采用乙醇提取發(fā)處理方法從對提取時間溫度、提取時間、乙醇濃度各因素進行研究，確定最佳的工藝；（2）采用超聲波技術(shù)從超聲時間、超聲溫度、乙醇濃度對東北原生種獼猴桃黃酮類化合物的提取工藝進行了優(yōu)化；（3）采用超臨界CO2萃取法中萃取時間、萃取溫度、萃取壓力三個因素進行了正交試驗和分析，確定CO2萃取的最佳工藝參數(shù)；（4）比較4種方法提取率的高低，以及各自的優(yōu)缺點。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料。市售東北原生種獼猴桃，經(jīng)過干燥、超微粉碎，貯存于干燥器中。

1.1.2 試劑。蒸餾水：分析純，市售。無水乙醇：分析純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≧99.7%，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠。亞硝酸鈉：分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠。硝酸鋁：分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：生化試劑，遼寧省生物醫(yī)藥研發(fā)中心。氫氧化鈉：分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠。

1.1.3 儀器設(shè)備。真空冷凍干燥機LG－5，上海市離心機研究所；高速萬能粉碎機FW－100，天津市泰斯特儀器有限公司；電子分析天平AB104－N，梅特勒－托利多儀器上海有限公司；CO2超臨界萃取裝置，南通市華安超臨界萃取有限公司；數(shù)控超聲波清洗器KQ－100DE，昆山市超聲儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋DK－98－1，天津市泰斯特儀器有限公司；低速離心機LD5－2A，北京醫(yī)用離心機廠；紫外分光光度計UV－2550，日本島津。

1.2 試驗方法

1.2.1 東北原生種獼猴桃黃酮類化合物含量的測定1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定。準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用95%乙醇溶解，定容50mL，得到0.2g／L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，備用。按梯度準(zhǔn)確吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL分別加蒸餾水定容至6mL；加入5%的NaNO2溶液1.0mL，搖勻，放置6min；加入10%的 Al（NO3）3溶液1.0mL，搖勻，放置6min；加入10%的NaOH溶液10mL，搖勻，放置15min，以吸取0mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的測試樣為空白樣調(diào)零。于510nm波長處測定吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.1.2 獼猴桃黃酮類化合物的測定。吸取提取液1.0mL，加蒸餾水定容至6mL；加入5%的NaNO2溶液1.0mL，搖勻，放置6min；加入10%的 Al（NO3）3溶液1.0mL，搖勻，放置6min；加入10%的NaOH溶液10mL，搖勻，放置15min，以吸取0mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的測試樣為空白樣調(diào)零。于510nm波長處測定吸光度。以回歸方程計算其濃度。

本研究中將東北原生種獼猴桃黃酮類化合物的提取量定義為1g東北原生種獼猴桃粉末提取出黃酮類化合物的質(zhì)量，提取液中黃酮類化合物的濃度通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算得出的，黃酮類化合物提取量的計算公式如下：

提取量（mg／g）＝（C×V）／M

式中：C：提取液黃酮類化合物的濃度（mg／mL），V：提取液的總體積（mL），M：東北原生種獼猴桃粉末的用量（g）。

1.2.2 材料前處理。新鮮野生獼猴桃冷凍干燥，粉碎機粉碎，過篩，備用。

1.2.3 東北原生種獼猴桃黃酮類化合物的提取

1.2.3.1 乙醇提取法的條件確定

（1）提取時間對提取量的影響。準(zhǔn)確稱取1g獼猴桃粉末，配成乙醇濃度為50%（v／v）的1∶100料液，置于60℃水浴中，分別提取2、3、4、5、6h。

（2）提取溫度對提取量的影響。準(zhǔn)確稱取1g獼猴桃粉末，配成乙醇濃度為50%（v／v）的1∶100料液，分別置于40、50、60、70、80℃水浴中提取4h。

（3）乙醇濃度對提取量的影響。準(zhǔn)確稱取1g獼猴桃粉末，分別配成乙醇濃度為10%、30%、50%、70%、90%（v／v）的1∶100料液，置于60℃水浴中提取4h。

（4）乙醇提取法最佳提取條件的確定。為得到乙醇提取法的最佳提取條件，采用正交試驗設(shè)計。以提取時間、提取溫度和乙醇濃度為影響因素，以黃酮類化合物提取量為指標(biāo)，采用三因素三水平的正交表L9（33）進行試驗。

表1 乙醇提取法正交因素水平表

1.2.3.2 超聲提取法條件確定

（1）超聲溫度對提取量的影響。準(zhǔn)確稱取5g獼猴桃粉末，融入100mL乙醇濃度50%（v／v）料液，超聲功率100W，時間30min，超聲溫度分別為20、30、40、50℃。

（2）超聲時間對提取量的影響。準(zhǔn)確稱取5g獼猴桃粉末，溶入100mL乙醇濃度50%（v／v）料液，超聲功率100W，超聲溫度為30℃，超聲時間分別為15、30、45、60min。

（3）乙醇濃度對提取量的影響。準(zhǔn)確稱取5g獼猴桃粉末，溶入100mL乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%（v／v）料液，超聲功率100W，時間30min，溫度30℃。

（4）超聲波提取法最佳提取條件的確定。為得到超聲波提取法的最佳提取條件，采用正交試驗設(shè)計。以超聲溫度、超聲時間和乙醇濃度為影響因素，以黃酮類化合物提取量為指標(biāo)，采用三因素三水平的正交表L9（33）進行試驗。

表2 超聲波提取法正交因素水平表

1.2.3.3 超臨界CO2流體萃取條件確定

（1）萃取溫度對提取量的影響。選擇萃取溫度分別為40、50、60、70、80℃，萃取壓力25MPa，萃取時間2h。

（2）萃取壓力對提取量的影響。選擇萃取壓力分別為15、20、25、30、35MPa，萃取溫度70℃，萃取時間2h。

（3）萃取時間對提取量的影響。選擇萃取時間分別為0.5、1、1.5、2、2.5h，萃取壓力25MPa，萃取溫度70℃。

（4）超臨界CO2流體萃取最佳提取條件的確定。為得到超臨界CO2流體萃取的最佳提取條件，采用正交試驗設(shè)計。以萃取溫度、壓力、時間為影響因素，以黃酮類化合物提取量為指標(biāo)，采用三因素三水平的正交表 L9（33）進行試驗。

表3 超臨界CO2流體萃取正交因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇提取法最佳條件結(jié)果分析

2.1.1 提取時間對提取量的影響結(jié)果

圖1 提取時間對提取量的影響

表4 不同提取時間提取量差異顯著表

由圖1可知，隨著提取時間的增加，提取量逐漸增大，達到5h時提取量最高，提取時間大于5h時提取量呈下降趨勢。由表4可知，提取5h提取量最多，較其它處理差異顯著，因此提取5h提取時間為最佳條件。

2.1.2 提取溫度對提取量的影響結(jié)果

圖2 提取溫度對提取量的影響

表5 不同溫度時間提取量差異顯著表

由圖2、表5可知，提取量隨著溫度的升高而逐漸增加。80℃時提取量最大，較其它處理差異顯著。因此在80℃條件下進行提取效果最佳。

2.1.3 乙醇濃度對提取量的影響的影響結(jié)果

圖3 乙醇濃度對提取量的影響

表6 不同乙醇濃度提取量差異顯著表

由圖3可知，料液比在10%～50%區(qū)間時，提取量隨著乙醇濃度的增加而增加，乙醇濃度大于50%時，提取量隨著乙醇濃度的增加而減少。由表6可知，乙醇濃度在50%時提取量最高，較其它處理差異顯著。因此，最佳乙醇濃度為50%。

2.1.4 正交試驗結(jié)果

表7 編碼水平表

表8 正交試驗結(jié)果

由正交試驗表8可知，三因素極差B＞A＞C，說明影響提取量的主要因素依次為提取溫度、提取時間、乙醇濃度。6處理提取量最大，因此乙醇提法最佳提取條件為提取溫度80℃、乙醇濃度為60%、提取4h，此條件下可提取0.219OD黃酮。

2.2 超聲提取法最佳條件結(jié)果分析

2.2.1 超聲溫度對提取量的影響結(jié)果

圖4 超聲溫度對提取量的影響

表9 不同超聲溫度提取量差異顯著表

由圖4可知，超聲溫度在20～40℃時，提取量隨著溫度的升高而增加，超聲溫度超過40℃，提取量隨著溫度的增加而減少。由表9可知，超聲溫度在40℃時提取量最高，較其它處理差異顯著。因此，最佳超聲溫度為40℃。

2.2.2 超聲時間對提取量的影響結(jié)果

圖5 超聲時間對提取量的影響

表10 不同超聲時間提取量差異顯著表

由圖5可知，超聲時間在15～45min區(qū)間內(nèi)，提取量隨著時間的增加而增加，超聲時間大于45min時，提取量隨著時間的增加而減少。由表10可知，超聲時間在45min時提取量最大，較其它處理差異顯著。因此，最佳超聲時間為45min。

2.2.3 乙醇濃度對提取量的影響結(jié)果

圖6 乙醇濃度對提取量的影響

表11 不同乙醇濃度提取量差異顯著表

由圖6可知，乙醇濃度在40%～60%區(qū)間內(nèi)，提取量隨著乙醇濃度的增加而增加，乙醇濃度大于60%時，提取量隨著乙醇濃度的增加而減少。由表11可知，乙醇濃度在60%時提取量最大，較其它處理差異顯著。因此，最佳乙醇濃度為60%。

2.2.4 超聲正交試驗結(jié)果

表12 編碼水平表

表13 正交試驗結(jié)果

由正交試驗表13可知，三因素極差B＞A＞C，說明影響提取量的主要因素依次為超聲溫度、超聲時間、乙醇濃度。7處理提取量最大，因此超聲提法最佳提取條件為超聲溫度30℃、乙醇濃度為60%、超聲提取60min，此條件下可提取0.607OD黃酮。

2.3 超臨界CO2流體萃取結(jié)果

2.3.1 萃取溫度對提取量的影響結(jié)果

圖7 萃取溫度對提取量的影響

表14 不同萃取溫度提取量差異顯著表

由圖7可知，提取量隨著萃取溫度的升高而增加。由表14可知，萃取溫度在50℃時提取量最高，較其它處理差異顯著。因此，最佳萃取溫度為50℃。

2.3.2 萃取壓力對提取量的影響結(jié)果

圖8 萃取壓力對提取量的影響

表15 不同萃取壓力提取量差異顯著表

由圖8可知，萃取壓力在15～25MPa時，提取量隨著萃取壓力的升高而增加，萃取壓力超過25MPa，提取量隨著萃取壓力的增加而減少。由表15可知，萃取壓力在25 MPa、30MPa時提取量最高，較其它處理差異顯著。出于成本考慮，因此，最佳萃取壓力在25MPa。

2.3.3 萃取時間對提取量的影響結(jié)果

圖9 萃取時間對提取量的影響

表16 不同萃取時間提取量差異顯著表

由圖9可知，提取量隨著萃取時間增加而增加。由表16可知，萃取時間在60min、80min、100min時提取量最大，較其它處理差異顯著。出于成本考慮，因此，最佳萃取時間為60min。

2.3.4 萃取正交試驗結(jié)果

表17 編碼水平表

表18 正交試驗結(jié)果

由正交試驗表18可知，三因素極差B＞C＞A，說明影響提取量的主要因素依次為萃取溫度、萃取壓力、萃取時間。8處理提取量最大，因此萃取提法最佳提取條件為萃取溫度50℃、萃取壓力30MPa、萃取時間100min，此條件下可提取0.345OD黃酮。

2.4 各最佳提取方法比較結(jié)果分析

由表19可知，各最佳提取方法的提取量差異顯著，提取量依次為超聲提取法＞萃取法＞乙醇提取法。因此，超聲提取法為最佳提取方法。

表19 不同提取方法提取量差異顯著表

3 結(jié)論

3.1 乙醇提法最佳提取條件為：提取溫度80℃、料液比60%、提取4h，此條件下可提取0.219OD黃酮。

3.2 超聲提法最佳提取條件為：超聲溫度30℃、乙醇濃度為60%、超聲提取60min，此條件下可提取0.607OD黃酮。

3.3 CO2萃取提法最佳提取條件為：萃取溫度50℃、萃取壓力30MPa、萃取時間100min，此條件下可提取0.345OD黃酮。

3.4 最佳提取方法的提取量差異顯著，提取量依次為超聲提取法＞萃取法＞乙醇提取法。因此，超聲提取法為最佳提取方法。

［1］印萬芬.我國有經(jīng)濟價值的獼猴桃及其利用［J］.特產(chǎn)科學(xué)實驗，1981（3）.