清肺合劑HPLC 指紋圖譜研究Δ

曹瑩瑩，林能明，方 羅（浙江省腫瘤醫院，杭州 310022）

清肺合劑是我院依據經驗方開發的醫院制劑，由白花蛇舌草、浙貝母、夏枯草等10味中藥組成，功效清熱化痰解毒、軟堅散結消腫，具有抗腫瘤作用[1～3]，并可減輕放射性肺損傷，防治早期肺纖維化。目前，該藥用于治療肺癌及肺癌、放射性肺炎引起的咳嗽多痰、胸痛、咳血等癥，療效肯定[4，5]。由于歷史原因，清肺合劑尚無完整的質量評價體系。中藥指紋圖譜是一種用綜合、宏觀、非線性的分析觀念和質控模式來全面表征中藥組成特征及質量的分析技術，已成為國際認同、提倡并推薦的中藥質量評價手段[6，7]，在中藥各研究領域的應用日益廣泛[8，9]。因此，筆者應用二極管陣列（DAD）檢測器建立樣品的等吸收圖，優化并建立清肺合劑的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，以期全面、整體地反映制劑質量，保證制劑工藝和質量的穩定性，確保患者用藥安全。

1 儀器與試藥

1100 HPLC儀，包括四元梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、紫外DAD檢測器、數據處理工作站（美國Agilent公司）；BS 224S電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；Multifuge 3R+高速離心機（德國Thermo Scientific（Heraeus）公司）；SY2200超聲波清洗儀（上海超聲儀器設備有限公司，頻率：59 kHz，功率：90 W）。

綠原酸、咖啡酸、野黃芩苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為 110753-200413、110885-200102、110842-200504，均為供含量測定用）；對香豆酸、迷迭香酸標準品（成都曼思特生物科技有限公司，批號分別為A0143、A0004，純度均≥98%）；清肺合劑（浙江省腫瘤醫院制劑室，批準文號：浙藥 制 Z20050031，批 號 ：090602、090609、090630、090714、090728、090804、090825、090901、090915、091013、091020、091103、091117、091124、091201、091208）；乙腈、甲醇（色譜純，浙江臨海市浙東特種試劑廠）；水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

為保證制劑質量的穩定性和指紋圖譜的有效性，清肺合劑所用藥材的產地相對固定，產地如下：浙貝母（浙江）、白茅根（浙江）、重樓（云南、四川）、半枝蓮（浙江、江蘇）、夏枯草（貴州）、防己（浙江）、仙鶴草（浙江）、白花蛇舌草（浙江）、龍葵（浙江）、天龍（浙江）。

2 方法與結果

2.1 對照品貯備液的制備

精密稱取綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、迷迭香酸對照品分別為0.002 3、0.000 5、0.001 9、0.003 3 g，分別置于10 mL量瓶中；精密稱取野黃芩苷對照品0.010 2 g，置于100 mL量瓶中，分別用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度分別為0.230、0.050、0.190、0.102、0.330 g·L-1的綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、野黃芩苷和迷迭香酸對照品貯備液。4℃冰箱貯藏，備用。

2.2 供試品溶液的制備

精密量取清肺合劑2 mL，置于10 mL量瓶中，以水稀釋至刻度，精密稱重，超聲30 min，冷卻后補足失重，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱：Elit SinoChrom ODS-AP（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.01%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0→60 min，A的體積百分比為95%→66%）；檢測波長：330 nm；柱溫：50 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：50 μL。該色譜條件下樣品與對照品的指紋圖譜分別見圖1、圖2。

圖1 各批清肺合劑的HPLC指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprints of each batch of Qingfei mixture

圖2 對照品的HPLC指紋圖譜6.綠原酸；7.咖啡酸；9.對香豆酸；10.野黃芩苷；14.迷迭香酸Fig 2 HPLC fingerprint of substance control6.chlorogenic acid；7.caffeic acid；9.p-coumaric acid；10.scutellarin；14.rosmarinic acid

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取同一份清肺合劑供試品溶液適量，連續進樣6次，按“2.3”項下色譜條件進行測定。結果，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜3.0%，表明本方法精密度良好，符合指紋圖譜測定要求。

2.4.2 穩定性試驗 取同一份清肺合劑供試品溶液適量，按“2.3”項下色譜條件分別于0、2、4、8、16、24 h進樣測定。結果，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜3.0%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.3 重復性試驗 取同一批清肺合劑適量，共6份，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.3”項下色譜條件測定。結果，各主要共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均＜3.0%，表明本方法重復性良好。

2.5 指紋圖譜的建立

取16批清肺合劑適量，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.3”項下色譜條件進樣檢測得到指紋圖譜；并利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）”軟件生成清肺合劑對照指紋圖譜（見圖2），其中共有色譜峰16個，其峰面積占總峰面積的80.9%以上。經對照品保留時間和紫外吸收曲線對比確認，6號峰為綠原酸，7號峰為咖啡酸，9號峰為對香豆酸，10號峰為野黃芩苷，14號峰為迷迭香酸。其中對香豆酸色譜峰保留時間（約為（24.567±0.049）min）和峰響應值適中、分離度理想，確定為參照峰（S峰）。以9號色譜峰為參照，計算共有特征峰的相對峰面積和相對保留時間，可得各峰保留時間穩定，RSD在0.050%～0.508%之間。16批清肺合劑HPLC指紋圖譜共有峰的相對峰面積與相對保留時間見表1。

2.6 相似度評價

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）”軟件對所有樣品的指紋圖譜進行數據處理，并計算16批清肺合劑指紋圖譜間及其與對照指紋圖譜之間的相似度。結果，除批號為090915的樣品與對照指紋圖譜的相似度略低于0.9（0.894）以外，其余相似度均在0.936以上，表明各批樣品間的差異性較小。

表1 16批清肺合劑HPLC指紋圖譜共有峰的相對峰面積與相對保留時間Tab 1 Relative peak area and relative retention time of the common peaks of HPLC fingerprints of 16 batches of Qingfei mixture

3 討論

為了得到滿意的分離效果，筆者比較了不同填料色譜柱（SinoChrom ODS-AP、SinoChrom ODS-BP、Lichrospher C18、Zorbax Elipse XDB-C18）的試驗效果，結果以SinoChrom ODS-AP柱的分離效果最佳。由于合劑中的成分眾多，各化合物紫外吸收行為差異較大，故筆者同時采用DAD檢測器建立樣品的光譜-色譜3D吸收圖和等吸收圖，直觀、便捷、快速、準確地選擇適宜的檢測波長，考察190～400 nm區間不同波長下的圖譜，結果在330 nm波長下，色譜基線平穩，噪聲干擾較小，各洗脫區段出峰均勻，色譜峰吸收豐度適中，圖譜信息完整。流動相的pH值和溫度對分離效果的影響較大，故筆者分別以甲醇/乙腈和乙酸-乙酸銨緩沖系、磷酸-磷酸鹽緩沖系、三氟乙酸緩沖液的不同配比、不同濃度的流動相系統進行梯度洗脫試驗，比較不同洗脫條件下的色譜圖，選擇分離效果好、峰數多、峰形佳、時間盡可能短的最佳色譜條件，最終確定以0.01%磷酸溶液和乙腈進行梯度洗脫，能有效改善峰形，提高分離度，使基線漂移小。此外，選擇較高的柱溫也有利于分離。

通過相似度計算發現，16批樣品的相似度較高，均具有相同的色譜特征峰，分離分析效率高，且各色譜特征峰保留時間穩定；相似度計算結果提示，清肺合劑的批間穩定性較高，各批制劑的質量具有一致性，表明本試驗所建立的指紋圖譜具有穩定性和可控性。

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