人參皂苷Rg1聯合BMSCs對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用

包翠芬，包翠芳，李 磊，劉 霞

(1遼寧醫學院科學實驗中心，遼寧錦州121000;2錦州市中心醫院;3遼寧醫學院組胚教研室)

研究發現，有效劑量的人參皂苷Rg1能夠改善腦缺血損傷的神經功能癥狀、減輕腦梗死程度［1］。另外，人參皂苷Rg1作為骨髓間充質干細胞(BMSCs)的誘導劑可以促進BMSCs分化為神經元樣細胞。目前，關于人參皂苷Rg1與BMSCs聯合應用治療缺血性腦病的研究還未見報道。2011年3～12月，我們通過體內模擬腦缺血模型，同時聯合應用人參皂苷Rg1及BMSCs進行干預，從分子水平和基因水平探討二者聯合應用對于缺血性腦病的保護作用及可能機制，為防治缺血性腦病提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠(以排除雌激素影響)25只，體質量為(250±50)g，隨機分為正常對照組(A組)、模型組(B組)、BMSCs治療組(C組)、人參皂苷Rg1治療組(D組)、BMSCs和人參皂苷Rg1聯合治療組(E組)各5只。人參皂苷Rg1(純度＞95%)購自吉林大學有機化學教研室;DMEM、F12培養基、胎牛血清(Hyclone公司);BrdU(SIGMA公司);兔抗大鼠 BrdU、NSE單克隆抗體(博奧森公司);PV6001二抗試劑盒、DAB試劑盒(北京中杉公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的培養及體外標記 取4周齡 SD大鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉，100%乙醇浸泡，無菌條件下于髂骨抽取骨髓;采用胰酶消化，紗網過濾、離心、棄上清，以分離細胞;加入標準培養液重懸，純化為單細胞懸液;計數，接種，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養;隔日換液，定期觀察，記錄生長曲線。取第3代細胞，采用BrdU進行標記，標記48 h后進行腦室內注射。

1.2.2 腦缺血模型的制備及給藥方式 10%水合氯醛腹腔麻醉，采用腦室內注射法將標記的BMSCs細胞懸液(5×105)一次性注入右側腦室內(C組、E組);除A組外，其余各組均采用改良線栓法制備大鼠右側大腦中動脈缺血模型。栓塞4 h后，將魚線輕輕拔出并縫合皮下筋膜及皮膚，即為再灌注模型。術后，D組、E組分別腹腔注射人參皂苷Rg1(20 mg/kg)，每日1次，B組、C組分別腹腔注射等量的生理鹽水。動物清醒后參照Zea Longa的5分制評分標準，采用單盲法進行神經功能缺損程度判定，取3～4分大鼠納入實驗。

1.2.3 組織樣本的制備 各組大鼠于造模后4周采用單盲法進行神經功能缺損評分后，用4%多聚甲醛全身灌注，在前囟尾側4.6～2.6 mm間冠狀切取腦組織塊，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切片厚度5μm。

1.2.4 尼氏染色及圖像分析 取以上各組切片常規脫蠟至水，經1% 焦油紫染液染色后，快速脫水透明，封片，光鏡下觀察(神經元的尼氏體呈藍紫色)。采用CIAS-1000型細胞圖像分析儀計數400倍視野下結構完整的神經元數量。

1.2.5 免疫組化染色檢測BrdU、NSE的表達 取上述切片常規脫蠟至水，3%H2O2處理30 min以去除內源性過氧化物酶，高壓修復抗原，分別滴加1∶100稀釋的兔抗大鼠BrdU、NSE抗體，4℃過夜，滴加辣根酶標記羊抗兔多聚體，37℃孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。陰性對照用PBS替代一抗DAB顯色。采用CIAS-1000型細胞圖像分析儀計數每個視野下陽性細胞百分率。

1.2.6 統計學方法 應用SPSS10.0統計軟件，數據均用ˉx±s表示。多組間差異性檢驗采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組神經功能癥狀評分及神經元計數 造模后動物清醒時A組活動自如，局灶性肌力無減弱，未見神經功能缺損癥狀;其余各組均出現明顯的神經功能缺損癥狀。4周后各組大鼠神經功能缺損癥狀均有不同程度的改善，其中E組最為顯著。焦油紫染色可見A組右側皮層神經元形態正常，細胞質中可見深紫色尼氏體;B組正常神經元數量顯著減少，尼氏體明顯減少甚至消失;C、D、E組神經元存活數量得到不同程度地提高，與B組比較差異有統計學意義，其中E組與A組比較無統計學差異。見表1。

表1 各組大鼠神經功能評分、大腦皮層神經元密度比較(ˉx ± s)

2.2 BrdU、NSE蛋白表達 造模4周后免疫組化染色A、B、D組未見BrdU蛋白陽性表達細胞;C、E組可見梗死區附近有細胞核黃染的BrdU蛋白陽性細胞。C、E兩組BrdU蛋白表達比較無統計學差異。NSE陽性定位于細胞質。造模4周后A組為正常的腦細胞形態，神經元胞質及突起呈較強的NSE蛋白陽性表達。B組細胞排列紊亂，細胞呈三角形或梭形，間質疏松，可見少量的神經元NSE蛋白陽性表達;與B組比較，C、D、E組的形態結構有不同程度的改善，且NSE蛋白陽性表達增強，以E組最為顯著。見表2。

3 討論

近年有研究表明，BMSCs移植對于缺血性腦病的治療具有重要的作用。Kopen等［2］將BMSCs注入新生的小鼠側腦室，并經小鼠的前腦和小腦到達宿主的大腦內，而不破壞宿主的腦內結構，這一實驗開始了BMSCs治療腦部疾病的新時代;朱潔等將未經誘導的BMSCs直接注入CIRI大鼠腦內，通過示蹤法發現移植BMSCs向缺血性腦損傷區定向遷移。

BMSCs雖然是缺血性腦病移植的理想種子細胞，但是深入研究發現，BMSCs于體外誘導為神經細胞后存活率可高達80%，但在體內僅為3% ～10%，并且存活時間不超過1周。推測可能與體內微環境的改變有關。當腦組織缺血缺氧時，組織內興奮性氨基酸、氧自由基、黏附分子、炎癥因子分泌增多等因素，導致腦細胞生存微環境改變，影響BMSCs的存活和增殖。BMSCs移植的低存活率大大地影響了其治療效果，因此，尋找一種有效的促進BMSCs增殖、提高BMSCs存活率的方法成為當前研究的熱點。

近年來研究表明，某些藥物可以與BMSCs聯合應用治療腦缺血。如 Li等［3］聯合應用腦脈通與BMSCs治療腦缺血，結果顯示聯合用藥組神經功能缺損癥狀顯著改善。但是沒有證據顯示二者聯合應用可以促進BMSCs的增殖、提高BMSCs存活率。

人參皂苷Rg1是傳統“補氣生血”藥人參的根、莖提取物，具有明顯的神經保護作用。近年來，部分學者開始將人參皂苷Rg1應用于缺血性腦病的實驗研究中。此外，人參皂苷Rg1還可以作為干細胞的誘導劑促進干細胞的定向分化，并且可以誘導干細胞的增殖。研究顯示，人參皂苷Rg1可以在體外促進大鼠BMSCs增殖、誘導BMSCs分化為神經元樣細胞，并且對內源性神經干細胞、血管內皮干細胞的增殖、分化起重要的調節作用［4～9］。本實驗結果顯示，聯合應用人參皂苷Rg1和BMSCs能夠顯著改善腦缺血大鼠的神經功能缺損癥狀，提高神經元存活率，而BrdU示蹤顯示聯合用藥組的移植細胞數量較單獨應用時顯著增多，并能促進損傷神經元的修復。其機制可能是Rg1作為小分子物質，易于通過血腦屏障，并且具有抗炎、抗氧化、清除自由基、改善神經功能缺損、減輕腦梗死體積、抑制細胞凋亡等作用，從而為BMSCs在腦內的存活及分化提供一個良好的微環境，有利于BMSCs在腦內的增殖。因此，人參皂苷Rg1與BMSCs的聯合應用可以為治療缺血性腦病的新方法提供實驗基礎。

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