納米材料PEG-PEI介導(dǎo)雙基因促體外擬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用

梁 兵，袁 芳，殷建瑞，蒲蜀湘，解龍昌，高慶春，高 聰

(廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，廣州510260)

在基因治療研究領(lǐng)域，載體問(wèn)題一直是最重要的核心問(wèn)題之一。我們前期合成并檢測(cè)了葉酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亞胺(PEG-PEI)在幾種葉酸表達(dá)豐富細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞毒性作用，證實(shí)PEG-PEI可以作為膠質(zhì)瘤基因治療的優(yōu)良轉(zhuǎn)染載體［1～3］。但PEG-PEI這種新型納米材料對(duì)于擬神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞)的轉(zhuǎn)染效果尚不明確。2010年10月～2011年12月，我們?cè)隗w外觀察了PEG-PEI介導(dǎo)CD和TRAIL基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞殺傷作用，以尋找神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的有效方法。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒DNA(pDNA)的制備 應(yīng)用前期合成的能表達(dá)綠色熒光蛋白的pIRES2-EGFP/CD-5-FC和pIRES2-EGFP/TRAIL質(zhì)粒，將質(zhì)粒在大腸桿菌中擴(kuò)增，然后用QIAGEN試劑盒提取純化，得到的質(zhì)粒通過(guò)紫外分光光度計(jì)在260、280 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其含量;在1.0%的瓊脂糖凝膠上以100 V電壓電泳40 min，檢測(cè)其完整性。檢測(cè)合格的質(zhì)粒保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)置于10%胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)液中，單層培養(yǎng)法傳代培養(yǎng)生長(zhǎng)至所需的細(xì)胞數(shù)，在接種前再傳代1次，24 h后更換1次培養(yǎng)液。在細(xì)胞于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大約80%時(shí)，以0.25%胰酶消化，收集消化液離心后去除上清液，Hanks液吹打沖洗2次后以Hanks液制成細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/10μL Hanks液，置于37℃水浴待接種。臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力＞95%。

1.3 PEG-PEI/pDNA復(fù)合物的制備 在Eppendorf管中，將總量1μg的pDNA稀釋在50μL不含F(xiàn)BS的DMEM中，振蕩均勻，按不同N/P比(即PEG-PEI/pDNA比)把相應(yīng)量的PEG-PEI加入到另外一管裝有50μL不含F(xiàn)BS的DMEM的Eppendorf管中，然后把兩溶液在室溫下振蕩5 min得到均勻復(fù)合物。

1.4 MTT法細(xì)胞凋亡檢測(cè) SH-SY5Y細(xì)胞以每孔6×103接種在96孔板中，24 h后每孔加入含有300 ng質(zhì)粒的PEG-PEI/pDNA復(fù)合物(其中先檢測(cè)N/P=5～30時(shí)，質(zhì)粒為 pIRES2-EGFP/CD-5-FC和pIRES2-EGFP/TRAIL;之后再檢測(cè) N/P=15時(shí)，質(zhì)粒分別為 pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP/CD-5-FC、pIRES2-EGFP/CD-5-FC+pIRES2-EGFP/TRAIL以及 pIRES2-EGFP/TRAIL)的 150μL無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)染，4 h后改為完全培養(yǎng)基，同時(shí)加入10μg/mL的5-FC，每個(gè)濃度復(fù)制在4個(gè)孔中。72 h之后加入20μL MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸出孔內(nèi)培養(yǎng)上清液后，加入100 μL DMSO，室溫振蕩5 min后，通過(guò)化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的吸光度值。

1.5 倒置熒光顯微鏡細(xì)胞凋亡觀察 將SH-SY5Y細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種在24孔板上培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞豐度70%，在轉(zhuǎn)染前4 h用不加 FBS的DMEM培養(yǎng)基置換培養(yǎng)液;然后把其吸走后每孔加入含有1μg pDNA不同N/P比的復(fù)合物和200μL不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基。在37℃下培養(yǎng)4 h，吸去轉(zhuǎn)染液，加入完全DMEM培養(yǎng)基在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)20 h。按N/P=15計(jì)算，將4組質(zhì)粒pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP/CD-5-FC、pIRES2-EGFP/CD-5-FC+pIRES2-EGFP/TRAIL以及pIRES2-EGFP/TRAIL(質(zhì)粒總量各為1μg)分別同納米材料復(fù)合后對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染，4 h后改為完全培養(yǎng)基，同時(shí)加入10μg/mL的5-FC，每個(gè)濃度復(fù)制在4個(gè)孔中。72 h之后棄去上層培養(yǎng)液，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀測(cè)pDNA在SH-SY5Y細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果及細(xì)胞存活情況，照片用Nikon熒光軟件捕獲。

1.6 流式細(xì)胞儀細(xì)胞凋亡檢測(cè) 如上述準(zhǔn)備好細(xì)胞后，按N/P=15計(jì)算，將4組質(zhì)粒pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP/CD-5-FC、pIRES2-EGFP/CD-5-FC+pIRES2-EGFP/TRAIL以及pIRES2-EGFP/TRAIL(質(zhì)粒總量各為1μg)分別同納米材料復(fù)合后對(duì)SHSY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染，4 h后改為完全培養(yǎng)基，同時(shí)加入10μg/mL的5-FC，每個(gè)濃度復(fù)制在4個(gè)孔中。72 h之后棄去上層培養(yǎng)液，細(xì)胞用500μL Hanks平衡鹽溶液懸浮，然后應(yīng)用FACSAria TM系統(tǒng)計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞的百分比。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，不同處理方式間的差異性采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 除去高濃度納米粒子的毒性作用，在N/P=15時(shí)PEG-PEI轉(zhuǎn)染兩種目的基因中單一基因的細(xì)胞凋亡作用最強(qiáng)(P＜0.01)，見圖1。而在不使用納米材料的情況下，兩種基因的細(xì)胞凋亡作用幾乎可以忽略不計(jì)。當(dāng)兩種基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞時(shí)，其促細(xì)胞凋亡作用明顯提高，細(xì)胞凋亡率達(dá)到77%，比單一基因提高了27%(P ＜0.01)，見圖2。

2.2 倒置熒光顯微鏡細(xì)胞凋亡觀察結(jié)果 在N/P=15時(shí)，將兩種PEG-PEI/基因復(fù)合物在SH-SY5Y細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，然后分別用倒置熒光顯微鏡觀測(cè)。在EGFP空白質(zhì)粒組中，綠色熒光很多，細(xì)胞密度很高，提示細(xì)胞凋亡數(shù)很少(圖3-A)。在兩種 PEGPEI/基因復(fù)合物單獨(dú)轉(zhuǎn)染組中，綠色熒光較少，細(xì)胞密度不高，提示細(xì)胞凋亡數(shù)較多(圖3-B、C)。而在兩種PEG-PEI/基因復(fù)合物聯(lián)合轉(zhuǎn)染組中，綠色熒光很少，細(xì)胞密度很低，提示細(xì)胞凋亡數(shù)很多(圖3-D)。這一結(jié)果與MTT法得到的結(jié)果一致。

圖1 不同N/P比時(shí)PEG-PEI/基因復(fù)合物在SH-SY5Y細(xì)胞中的促細(xì)胞凋亡作用

圖2 N/P=15時(shí)PEG-PEI/基因復(fù)合物在SH-SY5Y細(xì)胞中的促細(xì)胞凋亡作用

圖3 倒置熒光顯微鏡觀測(cè)N/P=15時(shí)PEG-PEI/基因復(fù)合物在SH-SY5Y細(xì)胞中的促細(xì)胞凋亡作用

2.3 流式細(xì)胞儀細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 在N/P=15時(shí)，將兩種PEG-PEI/基因復(fù)合物在SH-SY5Y細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，然后分別用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。在EGFP空白質(zhì)粒組中，僅8%的細(xì)胞凋亡，見圖4。在兩種PEG-PEI/基因復(fù)合物單獨(dú)轉(zhuǎn)染組中，有大約45%的細(xì)胞凋亡，而在兩種PEG-PEI/基因復(fù)合物聯(lián)合轉(zhuǎn)染組中，細(xì)胞凋亡比例高達(dá)75%。聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞促凋亡能力明顯高于單基因轉(zhuǎn)染(P＜0.01)。這一結(jié)果與上述得到的結(jié)果一致。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)N/P=15時(shí)PEG-PEI/基因復(fù)合物在SH-SY5Y細(xì)胞中的促細(xì)胞凋亡作用

3 討論

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是兒童中第2種常見的實(shí)體瘤，占青少年腫瘤發(fā)病率的10%，屬于神經(jīng)嵴來(lái)源的惡性胚胎瘤。1970年12月Tumilowicz等建立了SHN-SH細(xì)胞系，其來(lái)源于1次骨髓活檢。SH-N-SH細(xì)胞系分為3個(gè)亞型:神經(jīng)瘤型亞克隆SH-SY5Y、非神經(jīng)元型有很強(qiáng)基質(zhì)附著性的亞克隆SH-EP和介于兩者之間的亞克隆SH-IN。SH-SY5Y中含有凋亡相關(guān)酪氨酸激酶，在調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，能夠誘導(dǎo)SH-SY5Y的分化，并且能增強(qiáng)其他誘導(dǎo)分化物的作用。作為擬神經(jīng)細(xì)胞模型，SH-SY5Y細(xì)胞系廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制和防止措施的研究中。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SHSY5Y細(xì)胞系是一種分化程度較低的腫瘤細(xì)胞，屬于神經(jīng)瘤型亞克隆，因此SH-SY5Y細(xì)胞繁殖快。由于其細(xì)胞形態(tài)、生理和生化功能與正常神經(jīng)細(xì)胞相似，故被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制和藥物作用機(jī)制方面的研究。臨床上很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病與細(xì)胞凋亡有關(guān)，SH-SY5Y是研究神經(jīng)元凋亡的最常用細(xì)胞模型。同時(shí)SH-SY5Y細(xì)胞在全反式維甲酸作用下可分化為神經(jīng)元表型的細(xì)胞，是一個(gè)研究神經(jīng)系統(tǒng)生理病理很好的細(xì)胞模型。

分子生物學(xué)的發(fā)展證實(shí)，神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與細(xì)胞的基因性病變有關(guān)。基因治療被認(rèn)為是從根本上治療甚至最終攻克神經(jīng)系統(tǒng)疾病的最有希望的途徑之一，常用的途徑包括自殺基因治療、控制細(xì)胞周期及誘導(dǎo)凋亡、免疫基因治療、抗血管生成基因治療以及應(yīng)用溶瘤病毒等［4］。由于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的產(chǎn)生多存在異源性，即涉及到多個(gè)基因(有時(shí)還涉及到未明基因)，單純地阻斷或下調(diào)某一種(有時(shí)甚至幾種)基因的表達(dá)，往往仍然不能獲得理想的效果，因此聯(lián)合基因治療研究近年發(fā)展較快。聯(lián)合基因治療可彌補(bǔ)單一基因治療的不足，提高基因治療的療效，是神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的趨勢(shì)之一［5］。

自殺基因是來(lái)自某些病毒或細(xì)菌的基因，可編碼特定的酶，正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞缺乏這種基因，如果將其導(dǎo)入靶細(xì)胞中，可使無(wú)毒性的前體藥物轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝產(chǎn)物干擾DNA合成，從而導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡［6］。自殺基因治療系統(tǒng)的種類較多，主要包括單純皰疹病毒Ⅰ型胸苷激酶—丙氧鳥苷系統(tǒng)、帶狀皰疹病毒胸腺嘧啶激酶—阿糖甲氧基嘌呤系統(tǒng)、胞嘧啶脫氨酶-5-氟胞嘧啶系統(tǒng)、硝基還原酶-CB1954系統(tǒng)等。經(jīng)典自殺基因一般編碼非哺乳動(dòng)物酶類，可將無(wú)毒的前藥轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨拘源x產(chǎn)物。其中胞嘧啶脫氨酶(CD)系由大腸桿菌和某些霉菌表達(dá)的一種酶，只存在于細(xì)菌、真菌體內(nèi)，蛋白分子量為52 kD，可促使5-氟胞嘧啶脫氨，轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶。5-氟尿嘧啶經(jīng)細(xì)胞代謝成為5-氟-2-脫氧尿嘧啶核苷酸，可抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻斷脫氧尿嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏ず塑账幔瑥亩种萍?xì)胞DNA、RNA和蛋白的合成，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此CD基因是腫瘤基因治療中應(yīng)用最多最重要的藥物敏感靶基因之一。同時(shí)幾乎所有的自殺基因治療系統(tǒng)都存在“旁觀者效應(yīng)”。不少研究表明，只要少量的自殺基因轉(zhuǎn)染的癌細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的癌細(xì)胞按一定比例混合后共同培養(yǎng)，不僅轉(zhuǎn)染的癌細(xì)胞被殺死，二者相互接觸后相鄰的未轉(zhuǎn)染的癌細(xì)胞也大量死亡，即“旁觀者效應(yīng)”，而幾乎所有的自殺基因治療系統(tǒng)都存在這種效應(yīng)［7］。目前，CD/5-FC自殺基因系統(tǒng)作為一種新型自殺基因治療系統(tǒng)越來(lái)越多地受到關(guān)注，并已應(yīng)用于多種惡性實(shí)體腫瘤的基因治療研究［8，9］。研究表明，自殺基因療法與其他基因療法聯(lián)合應(yīng)用有良好的療效，相互協(xié)調(diào)，可增加抗腫瘤效果，已成為目前研究的發(fā)展方向。近年研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL具有選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的特性，而對(duì)正常組織無(wú)損傷作用，因此在腫瘤治療中具有巨大潛力［10，11］。

安全高效的基因傳輸載體是實(shí)現(xiàn)基因治療的關(guān)鍵之一。陽(yáng)離子納米材料易于合成和改性、無(wú)免疫原性等優(yōu)點(diǎn)使其成為非病毒基因載體的一種重要類型;但由于其對(duì)細(xì)胞有正電荷相關(guān)的毒性、轉(zhuǎn)染效率較病毒載體低、缺乏傳輸特異性等缺點(diǎn)制約了其在臨床上的應(yīng)用。為了確認(rèn)PEG-PEI在SH-SY5Y細(xì)胞中轉(zhuǎn)染含目的基因的重組質(zhì)粒的效率，我們先檢測(cè)了不同N/P比時(shí)PEG-PEI/pIRES2-EGFPCD-5-FC以及PEG-PEI/pIRES2-EGFP/TRAIL基因復(fù)合物的促細(xì)胞凋亡能力，結(jié)果證實(shí)在N/P=15時(shí)PEG-PEI轉(zhuǎn)染的兩種目的基因各自的細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)。而在兩種基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞時(shí)，其細(xì)胞凋亡作用明顯提高，提示兩者聯(lián)合應(yīng)用通過(guò)抑制細(xì)胞毒性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡提高了細(xì)胞凋亡作用。為了更精確檢測(cè)兩種PEG-PEI/基因復(fù)合物在SH-SY5Y細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡能力，在N/P=15時(shí)，將兩種PEGPEI/基因復(fù)合物在SH-SY5Y細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，然后分別用倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)抑制能力明顯高于單基因轉(zhuǎn)染，進(jìn)一步證實(shí)了MTT法的研究結(jié)果。

由此可以得出結(jié)論，PEG-PEI介導(dǎo)的CD-5-FC/TRAIL聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染在SH-SY5Y細(xì)胞中具有很強(qiáng)的促細(xì)胞凋亡能力，PEG-PEI可以進(jìn)一步用于體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)疾病基因治療的研究。

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