慢性肝病患者肝螺桿菌血清抗體水平分析

李紅艷 張永貴 王 靜 季尚瑋 斯慶圖娜拉 王江濱 (吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春 130033)

1992年，美國國立癌癥研究所的病理學家在患有肝細胞癌的A/JCr小鼠的體內分離出一種新型螺桿菌，命名為肝螺桿菌(Helicobacter hepaticus，H.hepaticus)〔1〕。研究發現，健康小鼠腹腔注射肝螺桿菌后，可出現慢性活動性肝炎，并在肝細胞外間隙及肝內膽道系統內發現菌體，因此肝螺桿菌可能成為這種成年小鼠發生慢性肝炎及伴隨肝細胞癌的病因學因素。關于螺桿菌屬在人類肝臟疾病中可能起的作用知之甚少，但是在膽汁中通過 PCR檢測到 H.pylori的 DNA。Fox等〔2〕研究發現H.hepaticus，H.bilis以及其他腸肝螺桿菌可能在慢性膽囊炎和慢性肝病的發病中起作用。本研究比較不同人群血清中抗H.hepaticus－IgG抗體和抗 H.pylori－IgG抗體反應，同時分析兩種螺桿菌抗原之間的交叉反應，為進一步了解H.hepaticus在慢性肝病中可能起的協同作用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 病例資料 (1)病例組為吉林大學中日聯誼醫院消化內科2007年10月至2009年6月期間不同肝病患者76名〔男50例，女26例，平均年齡(40.7±15.8)歲〕;診斷基于病史、生化學、免疫學和肝組織學檢查。血清酶學升高和/或臨床癥狀持續超過6個月可診斷為慢性疾病，其中慢性病毒性肝病患者52例(慢性乙型病毒性肝病27例、慢性丙型病毒性肝病25例)，自身免疫性肝炎8例和慢性酒精性肝病16例，患者合并有肝硬化25例。(2)正常體檢人群:作為成年人代表性樣本，隨機選自吉林大學中日聯誼醫院體檢中心80例，正常體檢人群〔男44例，女36例，平均年齡(43.8±16.4)歲〕。(3)健康獻血者:80例隨機選自長春市中心血站，男42例，女性38例，平均年齡(35.6±10.6)歲。所有標本均檢測HBV和HCV陰性。所有標本保存在－20℃。

1.2 H.hepaticus、H.pylori標準菌株及培養 H.hepaticus標準菌株ATCC51450購自美國國家標準菌種保藏中心(ATCC)，H.pylori標準菌株SS1由中國疾病控制中心診斷室提供。H.hepaticus、H.pylori凍存菌株經布氏瓊脂培養基復蘇，于微需氧(5%O2，10%CO2，85%N2)、37℃、高濕度條件下分別培養7～10 d、3～4 d，可疑菌落經鑒定為 H.hepaticus及 H.pylori后進行純培養2～3代，備用。

1.3 H.hepaticus、H.pylori抗原制備 分別選取穩定傳代的H.hepaticus標準菌株ATCC51450及H.pylori標準菌株SS1，用無菌生理鹽水洗脫固體平板上的細菌，4℃、3000 r/min離心10 min后棄上清，重新加入生理鹽水并用毛細細管吹打，懸浮后再離心，收集細菌。然后用小體積無菌生理鹽水懸浮，冰浴超聲粉碎10 min，4℃、12000 r/min離心20 min，收集上清。細菌殘渣再超聲粉碎10 min，重復上述過程一次。合并兩次上清，測蛋白濃度，分裝后置－80℃保存，備用。

抗原濃度計算:超聲粉碎細菌抗原稀釋后，用U－341紫外可見分光光度計測260 nm和280 nm波長的吸光度值(A260、A280)，按下列公式計算濃度:

蛋白濃度(mg/ml)=(1.74×A280－0.75×A260)×稀釋倍數。

1.4 抗H.hepaticus、H.pylori多克隆抗體的制備 2 ml弗氏佐劑(首次免疫時應用弗氏完全佐劑，以后應用弗氏不完全佐劑)加熱后，放入無菌研缽內，冷卻后緩慢分別滴入已獲得的H.hepaticus、H.pylori超聲粉碎抗原(200 μg/ml)2 ml，研磨至乳白色黏稠的油包水乳劑。免疫方法采用背部多點注射法，即在家兔脊柱兩旁選6點皮下注射，每點注射0.2 ml，間隔10 d后再于上述部位選不同點注射。每次免疫的抗原量約100 μg。每次免疫1 w后，耳緣靜脈取血檢測抗體效價。當效價在1∶16以上時心臟采血分離血清制備抗H.hepaticus及抗H.pylori抗體。

1.5 血清抗 H.hepaticus－IgG抗體、抗 H.pylori－IgG抗體檢測

應用H.hepaticus、H.pylori超聲粉碎抗原包被ELISA反應板。將1∶100稀釋的待測血清100 μl加入H.hepaticus抗原包被的ELISA反應孔中，H.hepaticus、H.pylori抗原免疫兔子獲得的多克隆抗體作為陽性對照，H.hepaticus、H.pylori抗原免疫兔子前的血清作為陰性對照，PBS作為空白對照，封蓋后37℃孵育1 h。用漂洗液漂洗3次。每孔加入辣根過氧化物酶標記二抗(待測血清中加羊抗人二抗，陽性對照、陰性對照和空白對照中加羊抗兔二抗)(辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠及抗兔二抗由華特生生物技術有限公司提供)稀釋液(1∶500)100 μl，封蓋后37℃孵育1 h。漂洗3次后每孔加入顯色液100 μl，37℃避光顯色20 min，加入0.2 N的硫酸終止顯色。在酶標儀上讀取450 nm的光密度(OD)值。ELISA結果用相對抗體活性(relative antibody activity RAA)表示，RAA是參照標準(丙種球蛋白，山西康寶生物制品股份有限公司)的百分數作為吸光率值的修正均值。比較三組每種螺桿菌的RAA均值。

1.6 吸收試驗 為了吸收可能的抗體交叉反應，超聲處理H.pylori整個細胞，收集 H.pylori細胞用PBS(pH7.2)洗滌1次，冰內超聲處理8次，每次60 s，每次間隔30 s，平均輸出功率45 W。將1 ml超聲處理的細胞加入到PBS中，加入10 μl血清，在22℃孵育1 h，然后在6°C不停搖勻16 h。12000 r/min離心10 min移去細胞，收集上清液用于血清學檢查。作為對照，H.pylori抗體完全吸收，被吸收后的血清再次做ELISA，三組人群中H.pylori平均RAA值均低于吸收試驗前的水平。

2 結果

2.1 吸收試驗前后三組人群抗H.hepaticus－IgG和抗H.pylori－IgG抗體的相對抗體活性分析 吸收實驗前CLD患者抗H.hepaticus－IgG抗體RAA平均值明顯高于獻血者組和普通體檢人群組(P＜0.001);CLD患者和普通體檢人群抗H.pylori－IgG抗體的RAA平均值明顯高于獻血者(P＜0.001)。CLD組抗H.hepaticus－IgG抗體的RAA平均值在吸收試驗前后差異無顯著性變化(P＞0.05);普通體檢人群和獻血者抗H.hepaticus－IgG抗體的RAA平均值在吸收試驗后有所增高，但無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 吸收試驗前后三組人群抗H.hepaticus和H.pylori抗體的相對抗體活性(±s)

表1 吸收試驗前后三組人群抗H.hepaticus和H.pylori抗體的相對抗體活性(±s)

與CLD組比較:1)P＜0.001;與獻血組比較:2)P＜0.001

H.pylori CLD組 76 40.85±16.92 35.79±16.8041.23±18.502)組別 n 吸收實驗前 吸收實驗后體檢人群組 80 25.52±7.87 30.46±11.2242.10±11.342)獻血者組 80 17.93±7.321)18.22±7.11 27.26±8.03

2.2 CLD患者中不同肝病患者抗H.hepaticus－IgG抗體的相對抗體活性分析 CLD患者中除自身免疫性肝炎患者外，慢性乙型肝炎患者、慢性丙型肝炎及酒精性肝病患者抗H.hepaticus－IgG抗體的RAA均明顯增高，慢性丙型肝炎患者抗H.hepaticus－IgG抗體的RAA值明顯高于其他肝病患者(P＜0.001)，吸收試驗前后抗H.hepaticus－IgG抗體的RAA值無顯著性變化(P＞0.05)。見表2。

表2 CLD患者中不同肝病患者抗H.hepaticus抗體的相對抗體活性(RAA，±s)

表2 CLD患者中不同肝病患者抗H.hepaticus抗體的相對抗體活性(RAA，±s)

與丙肝患者比較:1)P＜0.001

組別 吸收試驗前 吸收試驗后乙肝患者(n=27) 34.70±12.021) 28.55±12.631)丙肝患者(n=25) 57.68±13.27 50.72±16.07自身免疫性肝炎(n=8) 17.83±4.241) 17.77±3.231)酒精性肝病(n=16) 32.97±8.261) 31.65±8.181)

3 討論

H.hepaticus自發現并分離至今，國內外研究顯示在世界范圍內不同品系實驗室小鼠中均不同程度存在H.hepaticus感染〔3〕。H.hepaticus主要定植于小鼠的下胃腸道及肝臟，除A/JCr小鼠外，還能誘發 C3H/HeNCr、BALB/cAnNCr、SCID/NCr等多種品系的小鼠發生腸道炎癥及慢性活動性肝炎，甚至并發肝癌〔1，4〕。螺桿菌菌屬是一組革蘭陰性、微需氧螺旋彎曲狀細菌，最初從人類及其他哺乳動物的胃組織中分離出來的〔5〕，研究顯示這類細菌可能與人或動物的胃腸道、肝膽系統和一些惡性腫瘤的發生相關〔6，7〕。因此進一步研究這些新型螺桿菌在人類肝病中可能的作用具有重要意義。

本研究三組人群中慢性肝病患者吸收試驗后H.hepaticus抗體反應仍保持較高水平，同時慢性肝病患者中除自身免疫性肝炎患者外，慢性乙型肝炎患者、慢性丙型肝炎及酒精性肝病患者抗H.hepaticus－IgG抗體的相對抗體活性均明顯增高，慢性丙型肝炎患者抗H.hepaticus－IgG抗體的相對抗體活性明顯高于其他肝病患者，表明這種螺桿菌抗原或其他未被鑒定的螺桿菌的抗體反應具有特異性，這種微生物有可能參與了慢性肝病的發病機制。在普通人群和獻血者吸收試驗后H.hepaticus的抗體反應反而有所增加，這一發現目前還無法解釋。

Roe等〔8〕在各種膽管疾病患者的膽汁中檢測螺桿菌DNA，應用螺桿菌屬特異性PCR在原發硬化性膽管炎和原發膽汁性肝硬化患者肝組織中檢測到螺桿菌包括H.pylori。在近50%患者膽汁和肝臟標本螺桿菌DNA陽性。在另一研究中〔9〕，膽管癌、肝細胞癌患者應用螺桿菌屬特異性引物檢測71%和75%肝臟標本螺桿菌屬PCR陽性。最近，一種與H.pylori相似的菌株從肝豆狀核變性肝硬化女性患者的肝臟中分離出來，證實螺桿菌可以感染人類肝臟。

總之，在本研究中發現H.hepaticus和H.pylori的細胞表面蛋白具有較高的交叉反應，提示菌屬特異性具有免疫原性蛋白用于酶免疫測定時需要鑒定和純化。慢性肝病患者抗H.hepaticus－IgG抗體的相對抗體活性在吸收試驗后仍保持較高水平，這些發現提示在慢性肝病患者體內存在H.hepaticus的感染，但其在人類肝病發生發展中可能的協同致病作用還需要進一步研究探討。

1 Fox JG，Dewhirst FE，Tully JG，et al.Helicobacter hepaticus Sp.Now，a microaerophilic bacterium isolated from lives and interstinal mucosal scrapings from mice〔J〕.Clin Microbiol，1994;32(5):1238－45.

2 Fox JG，Dewhirst FE，Shen Z，et al.Hepatic Helicobacter species identified in bile gallbladder tissue from Chileans with chronic cholecystitis〔J〕.Gastroenterology，1998;114:755－63.

3 Nancy ST，Xu SL，Nambiar P，et al.Enterohepatic helicobacter species are prevalent in mice from commercial and academic institutions in Asia，Europe，and North America〔J〕.J Clin Microbiol，2007;45(7):2166－72.

4 Li XT，Fox JG，Mark T，et al.SCID/NCr mice naturally infected with Helicobacter hepaticus develop progressive hepatitis，proliferative typhlitis，and colitis〔J〕.Infect Immuity，1998;66:5477－84.

5 Whary MT，Fox JG.Natural and experimental Helicobacter infections〔J〕.Comp Med，2004;54:128－58.

6 Maurer KJ，Ihrig MM，Rogers AB，et al.Identification of cholelithogenic enterohepatic Helicobacter species and their role in murine cholesterol gallstone formation〔J〕.Gastroenterology，2005;128:1023－33.

7 Myles MH，Livingston RS，Franklin CL.Pathogenicity of Helicobacter rodentium in A/JCr and SCID mice〔J〕.Comp Med，2004;54(5):549－57.

8 Roe IH，Kim JT，Lee HS，et al.Detection of helicobacter DNA in bile from bile duct diseases〔J〕.J Korean Med Sci，1999;14:182－6.

9 Nilsson H，Mulchandani OR，Tranberg KG，et al.Helicobacter species identified in liver from patients with cholangiocarcinoma and hepatocellular carcinoma〔J〕.Gastroenterology，2001;120:323－4.