川芎嗪對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠中MMP－9、TIMP－1表達(dá)的影響＊

李健芝 庾江東 劉玉明 胡 麗 劉麗君 周秀田 莫文娟

1 南華大學(xué)護(hù)理學(xué)院，湖南省衡陽(yáng)市 421001； 2 湖南省衡陽(yáng)市中心醫(yī)院 3 南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室

細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解失衡引起的基質(zhì)積聚是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的基本病理生理過(guò)程?；|(zhì)金屬酶系統(tǒng)（MMPS／TIMPS）是ECM降解過(guò)程中的關(guān)鍵性降解酶系之一，MMPS／TIMPS比例降低也是導(dǎo)致腎小球和腎間質(zhì)纖維化的重要原因［1］。川芎嗪是中藥川芎的有效成分之一，有擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)和減輕組織缺氧性損害、抗細(xì)胞凋亡以及抗組織纖維化的作用。然而對(duì)于其抗腎纖維化的作用機(jī)制仍不清楚。本文旨在通過(guò)建立單側(cè)輸尿管梗阻腎纖維化模型，以國(guó)際公認(rèn)的具有腎臟保護(hù)作用的血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦作為陽(yáng)性對(duì)照，觀察川芎嗪對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠腎臟組織基質(zhì)金屬蛋白酶－9（MMP－9）、金屬蛋白酶組織抑制因子－1（TIMP－1）表達(dá)的影響，探討其抗腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制，為臨床腎間質(zhì)纖維化的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 清潔級(jí)、健康SD大鼠由南華大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物部提供，體重220～250g，4～6周齡，生長(zhǎng)良好，普食喂養(yǎng)。兔抗鼠MMP－9多克隆抗體、兔抗鼠TIMP－1多克隆抗體、SABC免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB顯色劑均購(gòu)自武漢博士德生物有限公司。鹽酸川芎嗪注射液由鄭州卓峰制藥有限公司提供，批號(hào)：H20055479；纈沙坦膠囊，80mg／粒，由海南澳美華制藥有限公司提供，批號(hào)：101203。

1.2 模型建立與分組 將32只雌性大鼠隨機(jī)分為4組：Shan組（Sham組）、模型組（UUO組）、川芎嗪治療組（Lig組）、纈沙坦治療組（ARB組），每組8只。除Sham組外，其他3組大鼠均在無(wú)菌條件下行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)建立單側(cè)輸尿管梗阻模型，手術(shù)方法：2%戊巴比妥5ml／kg腹腔注射麻醉大鼠，取右側(cè)臥位，背部左肋下備皮，常規(guī)消毒，選左側(cè)背部肋下0.5cm為切口，打開(kāi)腹腔，游離左腎及左側(cè)輸尿管，將輸尿管用組織鉗托起，取中上段，兩端用絲線結(jié)扎后，剪斷左輸尿管，然后逐層縫合；Shan組打開(kāi)腹腔后分離左側(cè)輸尿管，并不結(jié)扎即關(guān)閉腹腔。Lig組、ARB組于手術(shù)前1d開(kāi)始灌胃給藥，1次／d，連續(xù)2周，川芎嗪40mg／（kg·d），纈沙坦1.5mg／100g。Sham組、UUO組用相同體積的生理鹽水灌胃。各組大鼠均于術(shù)后14d處死大鼠，處死后留取左側(cè)腎標(biāo)本，用10%中性甲醛固定6～24h后，脫水，常規(guī)石蠟包埋，制成3mm厚切片，切片做HE染色、Masson染色及免疫組化染色。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 血肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）的檢測(cè)：腹主動(dòng)脈采血，采用OlymusAU21000型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定Scr、BUN。

1.3.2 腎組織病理檢查：腎組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋、常規(guī)切片，厚度3μm，行 HE染色和 Masson染色。腎小管間質(zhì)病變的判斷：取Masson染色切片觀察各組腎小管間質(zhì)纖維化程度。按文獻(xiàn)［2］描述的方法進(jìn)行半定量評(píng)分，在光鏡下（×400），對(duì)每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)不含腎小球和大血管的腎皮質(zhì)視野進(jìn)行分析。腎小管間質(zhì)病變按以下3個(gè)參數(shù)決定：蛋白管型和腎小管的擴(kuò)張、壞死、萎縮；炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；間質(zhì)纖維化的程度。每個(gè)參數(shù)按0～3分評(píng)定（0＝正常，1＝輕度受損，2＝中度受損，3＝重度受損）。每個(gè)視野小管間質(zhì)的評(píng)分為0～9分，計(jì)算其均值作為該標(biāo)本的腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)。

1.3.3 腎組織免疫組織化學(xué)（SABC法）：兔抗鼠MMP－9多克隆抗體、兔抗鼠TIMP－1多克隆抗體、SABC法試劑盒及DAB顯色劑均購(gòu)自武漢博士德生物有限公司，按SABC法試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。應(yīng)用真彩色病理圖像分析系統(tǒng)對(duì) MMP－9、TIMP－1結(jié)果進(jìn)行分析，每張腎組織切片在400倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)面積相同的視野，攝取圖像，輸入圖像分析系統(tǒng)，對(duì)免疫組化陽(yáng)性信號(hào)進(jìn)行積分光密度圖像自動(dòng)測(cè)量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以（）表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 腎功能檢測(cè) 造模后UUO大鼠血尿素氮及肌酐均明顯升高，與Shan組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Lig組、ARB組與 UUO組，兩兩比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠Scr、BUN的變化（，n＝8）

表1 各組大鼠Scr、BUN的變化（，n＝8）

注：與Shan組比較，＊P＜0.05。

2.2 HE和Masson染色光鏡觀察結(jié)果 光鏡下Shan組腎臟腎小管結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)未見(jiàn)增寬，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小管基底膜光滑完整。UUO組腎小管上皮細(xì)胞彌漫空泡變性，多數(shù)腎小管擴(kuò)張、萎縮，多灶狀炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化。Lig組和ARB組間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞呈小灶狀浸潤(rùn)，少許上皮細(xì)胞腫脹，少許腎小管輕度擴(kuò)張，腎間質(zhì)未見(jiàn)明顯纖維化。Masson染色見(jiàn)Shan組腎臟的膠原染色主要位于腎小球基膜、Bowman囊、系膜區(qū)和腎小管毛細(xì)血管周圍，而腎小管周圍間質(zhì)部分則比較少；UUO組可見(jiàn)腎間質(zhì)大量膠原纖維增生，間質(zhì)膠原纖維呈藍(lán)色染色，間質(zhì)纖維化呈灶狀分布，腎小球病變不明顯，偶見(jiàn)腎小球局灶節(jié)段性硬化。Lig組和ARB組上述病變均有所減輕。見(jiàn)圖1、2。

圖1 各組腎組織病理變化（HE染色，×100）A：Shan組B：UUO組 C：Lig組 D：ARB組

圖2 各組腎組織病理變化（Masson染色，×400）A：Shan組B：UUO組 C：Lig組 D：ARB組

2.3 腎小管間質(zhì)損傷指數(shù) 腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)半定量評(píng)分UUO組明顯高于Shan組（P＜0.01），Lig組和ARB組明顯低于UUO組（P＜0.01），但Lig組和ARB組無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)半定量評(píng)分（，n＝8）

表2 各組大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)半定量評(píng)分（，n＝8）

注：與Shan組比較，＊P＜0.01；與 UUO組比較，#P＜0.01。

2.4 免疫組化結(jié)果 Shan組大鼠腎小管上皮細(xì)胞胞漿有少量 MMP－9、TIMP－1表達(dá)，腎小球和腎間質(zhì)細(xì)胞少見(jiàn) MMP－9、TIMP－1表達(dá)。UUO組可見(jiàn)MMP－9、TIMP－1表達(dá)較 Shan組明顯增強(qiáng)且分布面積增加，主要在皮髓交界的腎小管間質(zhì)區(qū)以及腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)明顯。Lig組和ARB組較模型組表達(dá)減弱，且分布面積減少，但二者無(wú)顯著性差異。

MMP－9、TIMP－1免疫組化積分光密度值UUO組較Shan組明顯上調(diào)（P＜0.01），Lig組和ARB組均較UUO組減少（P＜0.01），二者亦無(wú)顯著性差異。與Shan組比較，其他各組 MMP－9／TIMP－1比值均明顯下調(diào)（P＜0.01）。見(jiàn)表3、圖3、4。

圖3 腎組織MMP－9免疫組織化學(xué)染色（×400）A：Shan組B：UUO組 C：Lig組 D：ARB組

圖4 腎組織TIMP－1免疫組織化學(xué)染色（×400）A：Shan組B：UUO組 C：Lig組 D：ARB組

表3 各組大鼠腎臟 MMP－9、TIMP－1的積分光密度值比較（，n＝8）

表3 各組大鼠腎臟 MMP－9、TIMP－1的積分光密度值比較（，n＝8）

注：與Shan組比較，＊P＜0.01；與UUO組比較，#P＜0.01。

3 討論

單側(cè)輸尿管梗阻是目前公認(rèn)的導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化病理學(xué)改變的經(jīng)典模型，通過(guò)該模型可以有效地評(píng)價(jià)藥物對(duì)腎間質(zhì)纖維化的療效。本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠腎實(shí)質(zhì)萎縮，腎臟質(zhì)地變硬，腎盂擴(kuò)張，呈囊狀。腎小管上皮細(xì)胞萎縮，大部分腎小管管腔擴(kuò)張，間質(zhì)纖維組織增生，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明模型建立成功。

MMPs是降解ECM的關(guān)鍵酶，人們已發(fā)現(xiàn)20種MMPs，其中MMP－9又稱明膠酶B，主要降解明膠、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型膠原及層粘連蛋白、蛋白聚糖及彈性蛋白等，能降解完整的基底膜［3，4］。TIMP－1 是MMP－9的天然抑制劑，在ECM中與 MMP－9之間存在著微妙的平衡關(guān)系［5，6］，其機(jī)理是特異性地與MMP－9催化活化中心的鋅離子結(jié)合封閉其催化活性。

RQ Chen［7］等研究顯示，在大鼠 UUO模型中TIMP－1、TIMP－2及 MMP－2、MMP－9的 mRNA 及蛋白質(zhì)的表達(dá)在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)均顯著增高，MMP－2和MMP－9的蛋白質(zhì)水解活性逐漸下降。其活性下降與TIMP－1及TIMP－2蛋白質(zhì)表達(dá)的增加呈明顯的負(fù)相關(guān)。Zhang X［8］等研究顯示，TIMP－1過(guò)度表達(dá)增加了衰老大鼠腎間質(zhì)纖維化。同時(shí)，還有研究發(fā)現(xiàn)腎硬化［9］、糖尿病腎?。?0］等有ECM 增多的腎臟疾病均有 TIMP－1增多或 MMPs／TIMP－1比例降低。本實(shí)驗(yàn)免疫組化的結(jié)果顯示：術(shù)后2周，UUO組 MMP－9、TIMP－1表達(dá)較Shan組明顯增強(qiáng)且分布面積增加，但 MMP－9／TIMP－1減低，與國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果一致。上述的研究結(jié)果均提示TIMP－1高表達(dá)和 MMP－9／TIMP－1比例降低是導(dǎo)致腎臟纖維化的重要原因。

川芎嗪是中藥川芎的有效成分之一，屬酰胺類生物堿類，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪，有擴(kuò)張血管，抑制血小板聚集，改善微循環(huán)和減輕組織缺氧性損害，抗細(xì)胞凋亡以及抗組織纖維化的作用。本實(shí)驗(yàn)中Lig組MMP－9、TIMP－1表達(dá)較假模型組明顯減低且分布面積減少，與ARB組之間無(wú)顯著差異，提示川芎嗪與血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑的治療效果一致，可能通過(guò)恢復(fù)MMP／TIMP間的網(wǎng)絡(luò)平衡來(lái)減少細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白的合成，增加其降解，從而達(dá)到減輕或抑制腎小管間質(zhì)纖維化進(jìn)程的目的。

綜上所述，腎組織中 MMP－9、TIMP－1表達(dá)與腎間質(zhì)纖維化密不可分，川芎嗪通過(guò)下調(diào)MMP－9、TIMP－1表達(dá)可延緩腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展，為臨床防治腎間質(zhì)纖維化提供新的途徑。

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