三七總皂苷對肝癌高轉移細胞HCCLM3的抑制作用研究＊

陳 鵬，王志萍，李 文，胡明道

（昆明醫科大學第二附屬醫院，云南 昆明 650101）

原發性肝癌是我國男、女性因惡性腫瘤致死的第二和三位原因，五年生存率僅5%左右。究其原因，一是很多肝癌病人在診斷后腫瘤已不能切除；此外肝癌切除術后的轉移復發率高達60～80%。但目前尚缺少一種有效的方法預防肝癌術后復發轉移，肝細胞癌對大多數抗癌藥物敏感性差，傳統的化療藥物毒副作用大，療效不理想。因此尋找一種低毒副作用藥物能抑制肝癌術后復發轉移顯得很有意義。三七總皂苷是中藥三七的主要藥物成分，具有低毒副作用的特點，本文應用不同濃度三七總皂苷作用于高轉移性的人肝細胞肝癌細胞系HCCLM3，觀察對肝癌高轉移細胞增殖和形態的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 高轉移性的人肝細胞肝癌細胞系HCCLM3購買于復旦大學附屬中山醫院肝癌研究所。

1.1.2 藥物及試劑 三七總皂苷（從五加科人參屬多年生草本植物三七中提取的有效成分）購自昆明制藥集團股份有限公司，二苯基四氮唑溴鹽（MTT）為美國sigma公司產品，二甲基亞砜（DMSO）為美國Sigma公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養 HCCLM3細胞用含15%新生胎牛血清的高糖DMEM完全培養基于37℃、5%CO2、混合氣體的孵箱（95%飽和濕度）內培養。每2天換液1次。細胞單層貼壁生長，待長滿瓶底時，用胰蛋白酶消化液消化成單個細胞，繼續傳代。

1.2.2 MTT法測定細胞存活率 取對數生長期細胞，以4×103個／孔濃度接種于96孔板，每孔含100μl細胞懸液。每組設3個平行孔，并設空白對照。貼壁培養24h后，換含有終濃度為25、50、100、200、400mg／L三七總皂苷培養液繼續培養，對照組培養液僅含0.04%DMSO。分別培養24h、48h及72h后取出培養板，并加入20ul／孔的MTT繼續培養。3h后，吸盡每孔中的液體，加入二甲基亞砜150μl／孔，在震蕩器上震蕩5min，使結晶物充分溶解。在全自動酶標讀數儀上分別測定570nm波長處不同時間（24h、48h、72h）、不同藥物濃度下的吸光度值（A570），并計算細胞的存活率。存活率＝藥物組A570／對照組A570×100%。

1.2.3 一般形態觀察 將對數生長期的HCCLM3細胞消化，計數、調整濃度為3×105／mL，接種于6孔板中，1.0mL／孔，再加入高糖DMEM完全培養基1.5mL。待24h細胞貼壁開始生長后，換液并加入含0.04%DMSO（對照組）及200mg／L的三七總皂苷培養液，處理48h后于倒置顯微鏡下觀察細胞密度和細胞形態的變化并照相。

2 結果

2.1 MTT法檢測不同濃度三七總皂苷不同時間對 HCCLM3細胞增殖的影響 由以下表1可見不同濃度（25～400mg／L）的三七總皂苷處理HCCLM3細胞24～72h后，出現對細胞增殖不同程度的抑制作用。其中處理48h后三七總皂苷作用開始明顯，且具有明顯濃度依賴性，隨濃度增加抑制作用更明顯。從24～48h，三七總皂苷的作用具有時間依賴性，隨時間延長，作用更明顯，結果見表1。

表1 三七總皂苷對HCCLM3細胞存活率的影響（±s，%）

表1 三七總皂苷對HCCLM3細胞存活率的影響（±s，%）

同一時間治療組均數與對照組相比，＊P＜0.05；同一時間與上一組濃度相比，△P＜0.05；同一濃度與上一組時間相比，▲P＜0.05

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2.2 倒置顯微鏡下觀察三七總皂苷對HCCLM3細胞生長和形態的影響 置顯微鏡下HCCLM3細胞為多邊形上皮樣細胞，成單層生長，細胞間相互連接，胞漿豐富，胞核大而圓。經200mg／L的三七總皂苷處理48h后細胞密度降低，細胞相互分離，部分細胞脫落呈懸浮狀，并見細胞碎片。（見圖1）

3 討論

腫瘤所體現的各種惡性生物學行為是由單個腫瘤細胞來行使的，欲在這個層次上開展工作需要有一個適宜的研究對象－肝癌細胞系。本實驗采用復旦大學肝癌研究所建立的高轉移細胞系HCCLM3。該細胞能夠合成并分泌甲胎蛋白、白蛋白并細胞角質蛋白8陽性，具備肝癌細胞特點；用該細胞瘤組織原位接種于裸鼠肝臟，5周后腹壁轉移100%、腹腔內轉移80%、肝內轉移100%、膈肌轉移70%、肺轉移100%，具有良好的自發性轉移特性［1］。

中藥三七主要功用為化瘀止血，消腫止痛，目前也有三七提取物用于治療腫瘤的研究［2～4］。三七總皂苷是中藥三七的主要藥物成分。筆者的實驗以肝癌高轉移細胞為研究對象，研究發現三七總皂苷對肝癌高轉移細胞HCCLM3增殖具有抑制作用，并呈時間和劑量依賴關系。通過倒置顯微鏡觀察也發現200mg／L的三七總皂苷作用48h后貼壁細胞密度降低，細胞脫落死亡。

肝癌術后較高的轉移復發率是進一步改善肝癌預后的重大障礙。但目前尚缺少一種有效的方法預防肝癌術后復發轉移。云南省是三七的主要產地，三七具有低毒副作用的特點，開發三七的作為預防肝癌術后復發轉移的輔助藥物具有良好的臨床應用前景和重大的社會和經濟價值。筆者的研究發現三七提取物三七總皂苷對肝癌高轉移細胞具有抑制作用，作用機制尚待于進一步研究。

［1］李雁，湯釗猷，葉勝龍，等 .體內連續篩選法建立自發性肺轉移人肝癌細胞系［J］.中華醫學雜志，2002，82（9）：601～605.

［2］張志信，黃保貴，張仕秀，等 .三七莖葉總黃酮對SMMC－7721細胞增殖的影響［J］.云南中醫中藥雜志，2006，27（6）：37～38.

［3］王志斌，李軍祥，朱陵群，等 .三七提取物對 GES－1細胞及MNNG轉化后GES－1細胞增殖的抑制作用［J］.中西醫結合學報，2004，2（6）：445～448.

［4］楊芬，劉浩，余美玲，等 .三七粉對小鼠S180移植腫瘤的抑制作用及免疫能力的影響［J］.蚌埠醫學院學報，2009，34（3）：195～197.