大鼠急性腎損傷導致肝細胞凋亡的實驗研究*

包翠芬， 劉玉玲， 邵佑之

(遼寧醫學院科學實驗中心，遼寧 錦州 121001)

引起急性腎損傷 (acute kidney injury，AKI)的原因可以是缺血，如休克、腎移植、腎血管手術等，因此又叫缺血性 AKI(ischemic AKI，IAKI)[1];也可以是非缺血原因，如雙側腎切除(bilateral nephrectomy，BNx)后而導致的AKI叫非缺血性AKI(non－ischemic AKI)。臨床上AKI病人的死亡率很高。其中部分AKI病人的致死原因常常是腎外器官衰竭引起的，如AKI誘導的急性肝臟損傷(acute liver injury，ALI)[2]。然而 AKI誘導 ALI的機制至今尚不清楚[2－4]。原因之一是尚不十分清楚AKI引起的肝臟細胞受損在細胞學上有何特點。晚近一些報道提出AKI可引起非腎臟器官的細胞凋亡，并認為AKI引起細胞凋亡的器官是有選擇性的[5]。經腫瘤壞死因子受體 α (tumor necrosis factor receptor α，TNFRα)啟動、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)家族激活途徑的細胞死亡叫外源性凋亡(extrinsic apoptosis)[6－7]。應用caspase抑制劑可以阻止這種途徑凋亡的發生。這種途徑的細胞凋亡是否參與AKI所引起的肝細胞損傷國內外尚無詳細的報道。本文應用光、電鏡技術以及免疫印跡、免疫組織化學染色方法探討AKI導致肝細胞凋亡的細胞學特點。

材料和方法

1 動物

健康SD大鼠，雌雄各半，體質量200～250 g，購于遼寧醫學院實驗動物中心。

2 主要儀器及試劑

兔抗大鼠 TNFRα抗體、caspase－3抗體購自Abcam，PV6001 II抗試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物公司;石蠟切片機、超薄切片機(Leica);透射電鏡(日本電子公司)。

3 主要方法

3.1 動物的選擇及AKI模型的建立 健康SD大鼠按實驗條件分3組:IAKI組10只，苯巴比妥鈉麻醉后開腹，應用無損傷血管夾阻斷雙側腎動脈血流60min后放開血管夾;假手術(sham)組10只，手術過程同前，只是不阻斷腎動脈血流BNx組10只，行雙腎切除。3組動物關腹后于無菌條件下飼養24 h后取材。先經腹主動脈取血2 mL用于腎功能和肝功能的常規檢查。取部分左腎，肝左葉組織用于免疫印跡分析。然后采用2.5%多聚甲醛戊二醛灌流右腎、肝右葉組織進行光鏡、電鏡標本制備。

3.2 腎功能和肝功能的測定 應用自動生化分析儀，比色法測定血清肌酐(serum creatinine，SCr)和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，賴氏法測定丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)。

3.3 TNFRα和caspase－3免疫印跡測定 新鮮腎(只測caspase－3)和肝組織加入RIPA裂解液，0℃下剪碎和超聲波粉碎20 s后靜置30 min，4℃、12000 r/min離心20 min，留取上清液，BCA法測定蛋白含量，并按每20 μL含50 μg蛋白制成樣品，－20℃冰箱保存。取已制備樣品適量加入電泳槽，100 V電壓下電泳，轉膜，常溫下半干轉印，TBST沖洗后，5% 小牛血清白蛋白室溫封閉1～2 h。分別加入I抗(TNFRα抗體，caspase－3抗體，稀釋度為1∶1000)4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗脫3次，每次5 min;分別加入II抗(辣根過氧化酶標記的IgG抗體，稀釋度為1∶200)室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗脫3次，每次5 min;ECL發光顯色;采用β－actin作為內參照。掃描電泳條帶，用凝膠分析軟件分析各蛋白目的條帶吸光度。根據目的條帶與內參照條帶吸光度的比值表示待測蛋白含量。

3.4 光、電鏡標本的制備 經2.5%多聚甲醛戊二醛灌流固定的右腎，肝右葉組織再加入2.5%多聚甲醛戊二醛續固定24 h。部分梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，Leica RM2135石蠟切片機切片，厚度5～7 μm切片，HE染色。部分組織經1% 鋨酸固定，梯度乙醇、丙酮脫水，Epon812環氧樹脂包埋劑包埋，LKB－V超薄切片機1 μm半薄切片，甲苯胺藍染色后光鏡觀察，定位后再進行超薄切片，重金屬雙染，1200EX透射電子顯微鏡下觀察。

3.5 Caspase－3的免疫組織化學染色 采用石蠟切片免疫組化Envision法染色。切片常規脫蠟至水，3% 過氧化氫溶液處理30 min以去除內源性過氧化物酶，高壓修復抗原，分別滴加適當稀釋的Ⅰ抗(單克隆抗體caspase－3)，4℃過夜，滴加辣根酶標記羊抗兔多聚體(PV6001)37℃孵育 30 min，DAB顯色。以上各步驟之間用0.01 mol/L PBS洗滌3次，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。陰性對照用PBS替代Ⅰ抗。蛋白陽性表達呈棕黃色。

4 統計學處理

用SPSS 13.0統計軟件進行分析。數據用均數±標準差()表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 腎功能和肝功能檢查結果

BNx組動物血 BUN 為(36.1 ±2.1)mmol/L，SCr為(321±26)mmol/L。IAKI組動物血BUN為(39.1±2.7)mmol/L，SCr為(318 ±26)mmol/L。Sham 組動物血 BUN 為(4.2 ±0.8)mmol/L，SCr為(88 ±17)mmol/L。IAKI組 ALT為(378±33)U/L，BNx組為(367±43)U/L，sham 組為(97±22)U/L。與 sham組相比較，IAKI組和BNx組的腎、肝功能指標均有明顯差異(P ＜0.05)。

2 免疫印跡的結果

與sham組動物肝臟相比，無論是IAKI組還是BNx組動物肝臟的TNFRα和caspase－3的表達均明顯增強，見圖1A。與sham組腎臟相比，IAKI組腎臟caspase－3的表達增強，見圖1B。

3 光鏡下HE染色切片和caspase－3免疫組化染色觀察結果

3.1 腎臟 Sham組動物腎臟顯示出正常的組織學結構，見圖2A。IAKI動物腎臟腎小管大面積壞死，表現為細胞腫脹，崩潰脫落，有時整個小管截面細胞消失。特別在近髓質以及髓質外帶中近端小管細胞大片壞死，壞死細胞淺淡，細胞內大量空泡出現。在壞死的細胞之間可見大量散在的凋亡細胞，表現為細胞固縮，著色深，核染色質固縮表現，見圖2B。Caspase－3 IHC染色sham組腎臟呈陰性反應，見圖2C。IAKI組髓質外帶近端小管上皮內可見較多的caspase－3陽性細胞，陽性反應顆粒出現在細胞質內，見圖2D。

Figure1.The results of Western blotting.A:both IAKI and BNx rat livers had stronger expression of TNFRα and caspase－3;B:IAKI rat kidneys had stronger expression of caspase－3..n=10.＊＊P＜0.01 vs sham.圖1 免疫印跡結果

Figure2.Light microscopic photographs of rat kidneys with HE staining(A，B)and caspase－3 immunohistochemical staining(C，D)(×400).A，C:sham group;B，D:IAKI group.Arrows in B indicate apoptotic cells，while those in D indicate caspase－3－positive cells.圖2 各組大鼠腎臟HE染色和caspase－3免疫組化染色的光鏡照片

3.2 肝臟 Sham組動物肝臟呈正常組織表現，見圖3A。AKI誘導的肝臟發生了明顯的灶狀壞死，這種壞死灶可大可小，著色蒼白。在壞死灶內雖然可見排列紊亂的肝板但已無可辨認的肝細胞存在，被嗜酸性絮狀物所代替。絮狀物內無完整的肝細胞核，只殘留少許核碎片及粒細胞浸潤。此外還可見到固縮的肝細胞散在肝板內，細胞染色深，與周邊肝細胞明顯不同。有的細胞核固縮，有的核萎縮。細胞形狀分2種，一種細胞呈星狀，見圖3B，另一種呈球狀，見圖3C，前者細胞核萎縮，后者細胞核染色質固縮。

Sham組肝臟caspase－3 IHC染色呈陰性反應，見圖3D。AKI組肝臟可見較多的caspase－3 IHC染色陽性細胞，陽性反應顆粒出現在細胞質內，見圖3E、F，特別是在壞死灶周邊以及肝小葉界板內多見。

4 電子顯微鏡觀察所見

Sham組肝細胞顯示出正常結構:細胞核染色質疏松，核仁明顯，各種細胞器均發達，內含物豐富，見圖4A。AKI動物肝臟內呈星狀的固縮肝細胞表現出副凋亡特點:細胞基質電子密度高，細胞核萎縮，內質網呈小空泡串珠樣擴張，線粒體變性均質狀或空泡化，見圖4B。呈近球形的固縮肝細胞表現出了凋亡細胞結構特點:細胞皺縮，基質電子密度也高，線粒體、內質網等細胞器結構正常，細胞核染色質固縮，見圖4C。

Figure3.Light microscopic photographs of rat livers with HE staining(A，B，C)and caspase－3 immunohistochemical staining(D，E，F)(×400).A，D:sham group;B，E:BNx group;C，F:IAKI group.Arrows in B and C indicate pyknotic hepatocytes，while those in E and F indicate caspase－3 －positive hepatocytes.圖3 各組大鼠肝臟HE染色和caspase－3免疫組化染色的光鏡照片

Figure4.Electron microscopic photographs of rat hepatocytes(×8000).A:a photograph of a normal hepatocyte in sham group;B:a photograph of hepatocyte undergoing para－apoptosis in BNx group showed mitochondrial vacuolization and nuclear shrinkage;C:a photograph of a hepatocyte undergoing apoptosis in IAKI group showed cytoplasmic shrinkage and a nucleus with pyknotic and marginated chromatin.圖4 各組大鼠肝細胞電鏡圖像

討 論

大鼠腎缺血45～60 min再灌注24 h引起的AKI是國內外公認的IAKI動物模型，而BNx又是公認的非缺血性AKI的動物模型[3－4]。從研究的結果可以看出大鼠腎缺血60 min再灌注24 h后腎功能嚴重損傷，與雙腎切除24 h的動物血清BUN和SCr的水平相近，說明2組動物的腎功能都發生了損傷，也說明本文的缺血性和非缺血性AKI動物模型都是成功的。同時本文也發現IAKI動物和BNx動物都發生了血清ALT明顯增高，說明2組動物的肝臟功能受到了較嚴重的損害。

本文形態學觀察發現IAKI腎小管是腎缺血再灌注損傷的重災區。特別是近髓質和髓質外帶區域中的近端小管損傷尤為嚴重，表現為大面積上皮細胞壞死以及壞死細胞之間明顯的細胞凋亡，構成了IAKI動物急性腎功能損傷的病理學基礎。免疫印跡和免疫組化染色結果說明IAKI腎臟出現了明顯的caspase依賴的細胞凋亡，說明除了腎小管細胞壞死外細胞凋亡也構成了腎臟缺血60 min再灌注24 h后的一個不可忽視的細胞損傷方式。

從免疫印跡法檢測的結果可以看出 TNFRα蛋白在AKI(包括IAKI和BNx)動物肝臟內的表達明顯增強，說明AKI誘導的肝細胞凋亡是由于某些外源性因素通過TNFRα啟動而引起的。同時AKI動物肝臟的caspase－3蛋白表達明顯增強。免疫組化染色結果也證實caspase－3陽性細胞在AKI動物肝臟內的存在。現已公認caspase家族的激活可使受損細胞向細胞凋亡方向發展，具體的凋亡執行者(executor)是激活了的caspase－3，是外源性細胞凋亡的主要途徑。因此被稱作為caspase依賴性細胞死亡(caspase-dependent cell death)[6－7]。Hassoun等[8]發現腎缺血性再灌注損傷時肺臟內出現了經TNFRα啟動的caspase依賴性細胞死亡。本文的結果說明經TNFRα啟動的caspase依賴的細胞死亡也參與了AKI誘導的肝細胞損傷。這為AKI腎外器官特別是肝臟受損機理的研究提供了新的視野。

IAKI組動物和BNx組動物相比較會發現兩者腎功能衰竭的程度相近，免疫印跡法和免疫組化染色結果也相似，不同是前者體內有一對缺血60 min再灌注24 h內含細胞凋亡的腎臟而后者沒有。然而BNx動物肝臟內卻出現了與IAKI動物同樣的細胞凋亡，說明AKI誘導肝臟內的細胞凋亡是由于AKI所致尿毒物質引起的。而與IAKI引起的細胞凋亡無關。換句話說，在IAKI肝臟內的細胞凋亡并不是腎缺血再灌注損傷誘導的。

形態學觀察的結果說明細胞壞死和細胞凋亡共同構成了AKI誘導肝功能損傷的形態學基礎。本文用光學顯微鏡觀察發現了固縮肝細胞的出現。固縮肝細胞可分2種;一種呈球形，細胞核固縮，用電子顯微鏡觀察證明屬于細胞凋亡(圖4C)。而另外一種呈星形，它與Park及助手們在2011年光鏡下發現的相一致，遺憾的是他們當時沒有進行電鏡觀察，只把它歸于一種死亡的肝細胞，命名為固縮性細胞死亡(pyknotic cell death)[9]。我們也發現了這種細胞出現在AKI肝臟內，并用電鏡觀察發現它既不具有壞死細胞的形態學特點，也不具有細胞凋亡的表現。其細胞核萎縮但染色質無固縮邊聚的表現，細胞基質電子密度極高，細胞內被細小空泡化的內質網和空泡化的線粒體所充滿。這與副凋亡細胞的超微結構很相似。有學者認為副凋亡又稱為非溶酶體空泡性細胞死亡(non－lysosomal vesiculate cell death)，其細胞核不具有凋亡細胞核的表現，特點是由于內質網或線粒體空泡化而造成的細胞質死亡(cytoplasmic death)[10]。這些描述與本文電鏡下所見相同(圖4B)，因此我們認為Park所說的固縮性死亡是一種副凋亡的肝細胞。至于AKI引起肝細胞副凋亡的機制如何尚需要進一步探討。

綜上所述，我們認為:(1)AKI所致肝細胞凋亡可能是經TNFRα啟動的caspase依賴的細胞死亡;(2)副凋亡也參與了AKI所致肝細胞損傷。

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