SNCA和PARK16多態性與中國遼寧地區漢族帕金森病人的關聯分析*

羅 莎，田小菲，周懿舒，李馮銳，朱蘭卉，羅曉光，任 艷，龐 灝△

(1中國醫科大學法醫學院，遼寧 沈陽 110001;2東北師范大學生命科學學院，吉林 長春 130024;3河北北方學院基礎醫學院法醫系，河北 張家口 075000;4中國醫科大學附屬第一醫院神經內科，遼寧 沈陽 110001)

帕金森病(Parkinson disease，PD)是一種常見的中樞神經系統變性疾病，其中65歲以上人群PD患病率為1% ～2%[1]。PD在臨床上表現為靜止性震顫、肌強直、運動遲緩、步態異常等;病理改變主要包括中腦黑質多巴胺(dopamine，DA)能神經元缺失，殘存的神經元變性，以及Lewy小體在胞漿內的出現。目前為止，PD的病因尚不明確，但眾多的研究顯示PD可能與氧化應激、線粒體功能紊亂、環境毒素及遺傳因素等密切相關。

PD多為散發病例，其中僅有少數的患者為家族性。隨著對PD相關易感基因的研究，越來越多的證據表明PD患者中存在著多種遺傳危險因素。目前，在家族性PD中已經確定了約18個相關的基因，并分別命名為PARK1～18?？刂乒埠说鞍?α－synuclein)表達的基因SNCA(也稱為PARK1)是第一個被發現的與PD相關的致病基因，基因表達產物在PD發病過程中發揮著核心作用[2]。纖維狀共核蛋白是PD患者Lewy小體的主要成分，而且SNCA基因的突變可能與PD病人黑質紋狀體多巴胺能神經元的退行性變有關。PARK16基因是近來在日本和歐洲群體中進行的全基因組關聯研究(genome－wide association study，GWAS)發現的一個新的PD易患相關區域[3]，在這個位于人類染色體1q32的區域中包含SLC45A3、NUCKS1、RAB7L1、SLC41A1 和 PM20D1 等多個 PD候選基因。盡管來自上述2個PD易感基因中的部分單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)在國內外已經有相關報道[3－5]，但是這些易感因素與PD的相關性在中國遼寧地區群體中尚未有任何相關數據。因此，本研究借助多重PCR－限制性片段長度多態性(restriction fragment lenth polymorphism，RFLP)技術，同時調查了中國遼寧地區PD與正常匹配人群中PARK16基因的rs16856139和SNCA基因的rs3857059兩個SNPs位點的遺傳多態性，以期逐步建立中國遼寧地區PD人群中易感基因的相關遺傳學數據。

材料和方法

1 對象

中國遼寧地區漢族人群散發性PD患者213例，其中男112例，女 101例，平均年齡(62.39 ± 10.60)歲(24～85歲)，所有患者均由中國醫科大學附屬第一醫院神經內科學專家依據英國腦庫PD診斷標準進行診斷。對照組為隨機選擇的健康遼寧地區漢族個體，其中男128例，女86例，平均年齡(63.15±10.84)歲(34～84歲)。本研究得到我校倫理委員會批準，所有研究對象均簽署了知情同意書。

2 方法

2.1 基因組DNA提取 抽取研究對象外周靜脈血約3 mL，采用SDS－蛋白酶K－酚氯仿法提取基因組DNA，紫外分光光度計測定DNA濃度后，－20℃保存備用。

2.2 多重PCR引物 依據報道的SNCA和PARK16的基因組序列，經 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進行特異性比對，同時考慮接續的限制性內切酶Pvu II的識別序列特征，由上海生工合成，引物相關序列見表1。

表1 rs16856139和rs3857059的引物序列及PCR擴增相關參數Table1.Primer sequences and parameters for PCR amplification on rs16856139 and rs3857059 loci

2.3 多重PCR－RFLP及產物檢測 多重PCR是在一個20 μL的PCR反應體系中，包括1×Es Taq MasterMix(CWBIO，中國北京)，引物濃度均為 0.4 μmol/L，見表 1，50 ～100 ng 的基因組DNA。反應條件為:95℃預變性2 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，重復35個循環;最后72℃ 1 min。反應結束后，將2 μL PCR產物放入含有2.5 U Pvu II的限制性內切酶的反應體系中孵育2 h。酶切產物應用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(T=6%，C=5%)，分離后的凝膠應用 10×genefinder(Bio－V，中國廈門)染色后，紫外燈下觀察結果并照相保存。

3 統計學處理

采用統計分析軟件SPSS 13.0和PLINK 1.07(http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink/)[6]，對 PD 和正常人群組進行基因型的Hardy－Weinberg平衡吻合度檢驗，對兩組基因頻率和基因型頻率進行χ2檢驗，同時對兩組間數據的相關性進行統計學分析。

結 果

1 多重PCR－RFLP法對2個SNPs位點的基因型鑒定

PCR－RFLP進行基因型鑒定是一個簡單的DNA水平分析SNP的方法，合理選擇多個位點進行同步擴增，同時采用單一限制性內切酶進行消化及接續的片段長度分析，將是更為有效的SNPs分析手段。本研究選取2種PD易感基因中的2個SNPs位點為研究對象，其一的rs3857059位點如為rs3857059＞G，可與其相鄰堿基構成限制性內切酶Pvu II的識別序列;而另一個rs16856139位點的2種等位基因的堿基均不能與鄰近堿基構成Pvu II的識別序列，但是本研究采用錯配引物序列后可人為創建出Pvu II的識別序列。圖1為本研究中采用PCR－RFLP法同步得出的2位點基因型分型圖譜。rs16856139位點的PCR產物長度為212 bp，Pvu II酶切后仍然為212 bp的一個片段，為基因型TT;僅見一個195 bp的片段為CC基因型;同時見到215和195 bp的2個片段為CT基因型。rs3857059位點的PCR產物長度為164 bp，Pvu II酶切后仍然為164 bp的一個片段，為AA基因型;僅見一個112 bp的片段為GG基因型;同時見到164和112 bp的2個片段為AG基因型(片段大小如表1中所描述，但采用本研究的電泳條件，52 bp以下的片段從陽極側泳出)。本研究的結果顯示2個位點在所有樣品中均可成功擴增和進行基因型判定。

2 rs3857059和rs16856139位點的基因型頻率分布

應用上述分型方法，本研究對中國遼寧地區213例PD患者及214例正常個體的SNCA基因的rs3857059和PARK16基因的rs16856139位點的基因型頻率分布進行了調查，相關數據結果見表2。統計學檢驗表明PD組與對照組基因型觀察值與期望值符合Hardy－Weinberg平衡(P＞0.05)。

Figure1.The genotyping map of rs3857059 and rs16856139 loci determined by PCR －RFLP.圖1 rs3857059和rs16856139位點PCR－RFLP的基因型分型圖

表2 中國遼寧地區PD患者和正常人群中rs16856139和rs3857059位點基因型和等位基因頻率的分布Table2.Distribution of genotypic and allelic frequencies of rs16856139 and rs3857059 loci in PD patients and control people in Liaoning area of China

比較2個位點在2個不同組中基因頻率分布的數據顯示，PD組在rs3857059位點上的G等位基因頻率高于對照組(59.39%vs 49.77%)，且差異具有統計學意義(χ2=7.592，P＜ 0.01，OR=0.677，95%CI 0.517 ～0.888);PD 組在rs16856139位點上的T等位基因頻率明顯低于對照組(4.69%vs 11.21%)，差異有統計學意義(χ2=11.511，P ＜0.01，OR=0.390，95%CI 0.227 ～0.669)，見表 2。此外，本研究也對rs3857059和rs16856139兩個位點的多態性在性別上的差異進行了分析，相關遺傳學數據見表3。從表中可以看出，在男性群體中的rs16856139和rs3857059的疾病相關性較強(P＜0.01和 P＜0.05，OR=0.365和 OR=0.723)，但在女性群體中并不明顯。

討 論

目前為止已經發現的PD易感基因的SNPs超過數百個，這樣，在不同PD人群中鑒定出密切相關的易感基因中的SNPs具有重要的臨床意義。近來來自多個PD的GWAS研究顯示，集中在SNCA、PARK16、LRRK2和BST14個基因中的SNPs與不同種族的PD患者發病危險性相關[3－4]。SNCA是第一個鑒定的與PD發病密切相關聯的基因，基因定位在人類染色體4q21－q23上，由6個外顯子和5個內含子組成。研究表明SNCA具有調節突觸的可塑性、整合突觸的前信號、調節突觸處的多巴胺含量、熱休克蛋白樣作用及參與脂代謝調節等生理功能[7];病理上，SNCA基因表達的共核蛋白是Lewy小體的主要成分。這樣，SNCA基因的突變不僅可以導致家族性PD病人黑質紋狀體多巴胺能神經元的退行性變，異常的SNCA堆積也可引起癡呆、阿爾茨海默病、多系統萎縮及共濟失調等神經系統疾病[8]。因此，其基因突變引起PD的研究備受關注。最早觀察到的SNCA基因中的突變是A53T，之后在歐洲白種人PD家系中又發現了A30P和E46K，3個錯義突變可解釋部分白人群體中PD家系患病的原因。然而，在我國進行的A53T和A30P突變調查結果顯示，其不是中國家族性帕金森病的突變熱點，推測其在東方人群中是罕見的家族性帕金森病致病突變。2003年，蘇敬敬等[9]選擇SNCA基因的第3和第4外顯子中A377T和C243G兩個編碼區的SNPs為研究靶點，在散發性的PD人群中進行了發病風險的調查，結果排除了SNCA基因A377T和C243G兩個位點在散發性PD發病風險中的作用。Zhao等[10]首先在國內調查了共核蛋白基因啟動子區微衛星多態性，發現了這個微衛星多態與晚發性散發性PD的發病風險有關。Chang等[11]的GWAS對中國PD人群SNCA基因的3個SNPs進行了調查，分別定位在SNCA基因5’側翼區、3’側翼區和內含子序列中SNPs的基因型數據顯示，SNCA基因增加了PD患病的危險性。近來的GWAS在日本人群中的數據顯示，SNCA基因區域中發現了7個與PD相關的SNPs，其中的rs3857059(P=5.68 ×10－16，OR=1.36)和 rs11931074(P=7.35 × 10－17，OR=1.37)兩個位點與PD呈顯著相關[3]。幾乎同時發表的歐洲的 GWAS數據中，SNCA基因區域的 rs3857059、rs11931074及rs2736990構成白人群體中與PD顯著性相關的前三位SNPs位點[4]。SNCA基因這些不同地區和種族表現出的相關性數據，進一步證明SNCA在所有群體中為主要的PD患病危險因子。比較2個群體中rs3857059位點的數據，可發現同為PD患病危險相關位點，但是群體之間的等位基因頻率存在顯著性差異，提示在PD中存在群體特異性遺傳異質性。然而，目前對上述的GWAS水平發現的SNCA基因中的SNPs在其它群體內疾?。瓕φ战M相關性的研究報道甚少。本研究選擇定位在 SNCA基因內含子4中的rs3857059位點進行基因多態性分析，首次在中國群體中發現G等位基因頻率在PD患者組高于對照組，且差異具有統計學意義。這一結果符合日本群體中報導的數據，同時提示與PD發病遺傳學上密切相關的SNCA基因，盡管在中國人群中的編碼區未發現致病突變，但是非編碼區可能存在一定的與PD發病相關聯的SNP，本研究得到的數據也為進一步系統分析SNCA基因在中國PD人群中的作用提供了有意義的數據。

表3 不同性別中rs3857059和rs16856139的等位基因頻率分布Table3.Allelic frequencies of rs16856139 and rs3857059 loci between different sexes

SLC45A3(solute carrier family 45，member 3)是 PARK16區域中包含的基因之一，最初發現其與前列腺癌發病相關，產物也稱為前列腺相關蛋白6(PCANAP6)?；虻木幋a區長1662 bp，含有5個外顯子。Satake等[3]鑒定的存在于PARK16與 PD相關的 7個 SNPs，僅 rs16856139存在于SLC45A3基因中，定位在內含子1序列內。自從GWAS中相關PARK16的研究顯示日本人群中PD患者與該區域的部分SNPs密切相關后，以PARK16為靶點在不同地區和群體進行了廣泛深入的研究。GWAS結果及不同方法的易感位點復制實驗研究顯示，在大部分歐洲起源的PD群體與PARK16呈弱相關[4];在英國和西班牙北部調查的頻率數據顯示與PD不相關[12－13];智利 PD患者中的基因型與 PARK16基因相關[14]。相關的研究近期也在眾多的亞洲群體進行了報道。Chang等[11]調查了中國四川地區人群PARK16易感區域中的4個SNPs，發現包括rs16856139位點在內的3個次要基因與PD的低危險患病相關;來自中國浙江地區的rs16856139位點數據也顯示，其次要等位基因頻率在對照組明顯高于PD組，暗示了次要基因的保護性作用[15];日本學者在PARK16區域發現的7個多態性位點中，認為其中的rs947211與PD相關性最強，但rs16856139也表現出為PD相關聯的位點。然而，Tan等[16]報道的新加坡華人rs16856139位點數據與上述2個中國大陸地區的數據不同，頻率數據在PD與對照組之間差距不顯著。為了積攢更多的數據，同時也為了解PARK16基因SNPs在中國遼寧地區人群中分布的特征，本研究也對SLC45A3基因中的rs16856139位點進行了調查，結果顯示中國遼寧地區群體中能夠復制出日本、中國四川和浙江群體中觀察到的結果，但是與上述群體中報道的數據比較(如表4所示)，本研究的次要等位基因頻率更低，提示該位點除了存在的高度種族差異性外，可能同樣存在地域差異性。需要指出的是PD患者中PARK16的作用仍然是一個爭論的焦點，種族起源的不同及樣本大小可能導致了這些差異，但是進一步對SLC45A3基因其它相關SNPs位點的研究，以及對PARK16其它基因的SNPs研究將會為中國遼寧地區PD群體提供大量有意義的數據，也將會為系統分析這一基因對PD的作用提供幫助，同樣也是對GWAS完成后的接續復制研究的進一步鑒定。

表4 SLC45A3基因rs16856139位點次要等位基因頻率的比較Table4.Comparison of minor allelic frequencies of rs16856139 locus in SLC45A3 gene

綜上所述，本研究成功應用多重PCR－RFLP技術同時檢測了rs3857059和rs16856139的基因多態性;首次在中國遼寧地區群體中發現了這2個SNPs位點與PD患病的危險性相關。本研究將為探討SNCA和PARK16基因在PD發病中的作用提供有用的數據。

[1]Chaudhri KR，Buxton－Tomas M，Dhawan V，et al.Long duration asymmetrical postural treor is likely to predict development of Parkinson’s disease and not essential tremor clinical follow up study of 13 cases[J].J Neurol Neurosurg Psychiatry，2005，76(1):115 －117.

[2]Farrer MJ.Genetics of Parkinson disease:paradigm shifts and future prospects[J].Nat Rev Genet，2006，7(4):306－318.

[3]Satake W，Nakabayashi Y，Mizuta I，et al.Genomewide association study identified common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson’s disease[J].Nat Genet，2009，41(12):1303 －1307.

[4]Simón － Sánchez J，Schulte C，Bras JM，et al.Genomewide association study reveals genetic risk underlying Parkinson’s disease[J].Nat Genet，2009，41(12):1308 －1312.

[5]李冬輝，王 進，毛成潔，等.PARK16與蘇州地區漢族人帕金森病相關性研究[J].中華醫學雜志，2011，91(5):296－300.

[6]Purcell S，Neale B，Todd － Brown K，et al.PLINK:a tool set for whole－genome association and populationbased linkage analyses[J].Am J Hum Genet，2007，81(3):559－575.

[7]熊中奎，胡雅兒.α－突觸核蛋白的生物學功能及其在帕金森病中的作用[J].中國病理生理雜志，2010，26(9):1855－1858.

[8]張 蘭，于 順，邢 穎，等.APP轉基因擬癡呆小鼠模型腦內α－synuclein的增齡改變[J].中國病理生理雜志，2007，23(12):2289 －2294.

[9]蘇敬敬，謝惠君，趙武偉，等.散發性帕金森病患者γsynuclein基因的研究[J].中華醫學遺傳雜志，2003，20(5):444－446.

[10]Zhao XP，Zheng HM，Xie HJ，et al.The alpha－synuclein gene microsatellite polymorphism and late－onset sporadic Parkinson's disease susceptibility[J].Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi，2004，21(4):339 －341.

[11]Chang XL，Mao XY，Li HH，et al.Association of GWAS loci with PD in China[J].Am J Med Genet，2011，156B(3):334－339.

[12]The UK Parkinson’s Disease Consortium and The Wellcome Trust Case Control Consortium 2.Dissection of the genetics of Parkinson’s disease identifies an additional association 5'of SNCA and multiple associated haplotypes at 17q21[J].Hum Mol Genet，2011，20(2):345 －353.

[13]Mata IF，Yearout D，Alvarez V，et al.Replication of MAPT and SNCA，but not PARK16－18，as susceptibility genes for Parkinson’s disease[J].Mov Disord，2011，26(5):819－823.

[14]Ramirez A，Ziegler A，Winkler S，et al.Association of Parkinson disease to PARK16 in a Chilean sample[J].Parkinsonism Relat Disord，2011，17(1):70－71.

[15]Yan YP，Mo XY，Tian J，et al.An association between the PARK16 locus and Parkinson’s disease in a cohort from eastern China[J].Parkinsonism Relat Disord，2011，17(10):737－739.

[16]Tan EK，Kwok HK，Tan LC，et al.Analysis of GWAS－linked loci in Parkinson disease reaffirms PARK16 as a susceptibiliy locus[J].Neurology，2010，75(6):508 －512.