LMP1調節鼻咽上皮與鼻咽癌組織中p27與RPLP0蛋白的表達*

趙 強，張志偉，劉重元，楊 科，謝 妮，張 婕

(1腫瘤細胞與分子病理學湖南省高校重點實驗室，南華大學腫瘤研究所，2南華大學附屬第一醫院病理科，3南華大學醫學院，湖南 衡陽 421001)

EB病毒(Epstein－Barr virus，EBV)感染與鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)的發生密切相關[1]，其編碼的潛伏膜蛋白 1(latent membrane protein 1，LMP1)是重要的致瘤蛋白[2]。羧基端胞漿區是LMP1將信號轉導至細胞內、活化不同信號通路而發揮其生物學功能的重要部位，包含3個羧基端功能活性區(carboxyl terminal activating region，CTAR)，即 CTAR1、CTAR2和 CTAR3[3－4]。前期，我們篩選到LMP1調節的p27與核糖體磷蛋白大亞基P0(ribosomal phosphoprotein large P0，RPLP0)蛋白[5，12]。為進一步了解LMP1與調節蛋白質在組織中表達相關性，本文檢測LMP1調節的p27與RPLP0蛋白在鼻咽上皮和鼻咽低分化鱗狀細胞癌中的表達情況，分析蛋白質間的相互調節規律及臨床病理學意義，為揭示EB病毒與鼻咽癌發病的分子機制提供實驗資料。

材料和方法

1 材料

收集2009年8月～2010年10月南華大學附一醫院的鼻咽上皮組織石蠟塊30例(其中男性18例，女性12例，平均年齡35歲)和鼻咽低分化鱗狀細胞癌組織石蠟塊60例(其中男性41例，女性19例，平均年齡44.5歲)。另外收集鼻咽部活檢新鮮標本鼻咽上皮組織和鼻咽低分化鱗狀細胞癌組織各10例，其中LMP1陽性組織各5例。

2 免疫組織化學染色

將制備好的石蠟切片二甲苯脫蠟2次后水化;PBS洗片3次，每次3 min;浸入盛有枸櫞酸鹽緩沖液容器中微波爐加熱進行抗原修復;加3%過氧化物酶阻斷液，37℃ 15 min;PBS洗片3次，每次3 min;加足量非免疫性動物血清，37℃ 10 min;分別滴加Ⅰ抗(抗LMP1和p27蛋白抗體為福建邁新生物技術有限公司產品，克隆號為 CS1－4和 MAB－0242;RPLP0蛋白抗體為Abcam產品，克隆號為DCS－72.F6)，置濕盒中4℃冰箱過夜;滴加生物素標記的Ⅱ抗，37℃ 15 min;滴加鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶溶液，37℃ 15 min;DAB顯色、蘇木素復染、返藍、脫水、透明，封片，顯微鏡觀察、照相。陽性表達的判斷標準:淺黃色為弱陽性，黃色或棕黃色為中等陽性，棕色或深棕色為強陽性，無棕黃色或與背景著色一致為陰性。

3 Western blotting檢測蛋白表達

將收集的活檢鼻咽上皮組織與鼻咽癌組織按照LMP1(－)或(+)分別混合，剪碎、裂解、提取蛋白，測定蛋白濃度，以每孔30 μg總蛋白，經10%SDS不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，轉膜、封閉，p27或RPLP0蛋白Ⅰ抗(購自Santa Cruz;1∶1000)和Ⅱ抗(購自 Santa Cruz;1∶2000)孵育、發光、曝光、顯影、定影和分析結果。

4 統計學處理

采用 SPSS 13.0軟件進行數據處理，p27和RPLP0蛋白的表達采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 鼻咽上皮和鼻咽低分化鱗狀細胞癌組織中LMP1蛋白的表達

LMP1蛋白表達于胞膜和胞漿，見圖1，其中鼻咽上皮組織的表達率為73.3%，而鼻咽低分化鱗狀細胞癌組織中表率為90.0%，見表1，提示正常人群和鼻咽低分化鱗狀細胞癌患者組織中EBV感染率均較高。

Figure1.The positive expression of LMP1 protein in nasopharyngeal epithelial(A)and nasopharyngeal poorlydifferentiated squamous－cell carcinoma(B)tissues(SP，×400).圖1 LMP1蛋白在鼻咽上皮和鼻咽低分化鱗狀細胞癌組織中的陽性表達

2 鼻咽上皮和鼻咽低分化鱗狀細胞癌組織中p27蛋白的表達

p27蛋白表達于細胞核，見圖2。與LMP1(－)組織相比，p27蛋白在LMP1(+)的鼻咽上皮組織和鼻咽低分化鱗狀細胞癌中表達降低，見圖3，提示LMP1抑制鼻咽上皮組織和鼻咽低分化鱗狀細胞癌中p27蛋白的表達。

Figure2.The expression of p27 protein in nasopharyngeal epithelial(A，B)and nasopharyngeal poorly－differentiated squamous－cell carcinoma(C，D)tissues(SP，×400).A，C:LMP1 －negative expression;B，D:LMP1 －positive expression.圖2 p27蛋白在鼻咽上皮和鼻咽低分化鱗狀細胞癌組織中的表達

Figure3.The expression of p27 and RPLP0 proteins in nasopharyngeal epithelial(N)and nasopharyngeal poorlydifferentiated squamous－ cell carcinoma(C)tissues.圖3 p27和RPLP0蛋白在鼻咽上皮和鼻咽低分化鱗狀細胞癌組織中的表達

3 鼻咽上皮和鼻咽低分化鱗狀細胞癌組織中RPLP0蛋白的表達

RPLP0蛋白表達于胞核和胞漿，見圖4。與LMP1(－)組織比較，RPLP0蛋白在LMP1(+)的鼻咽上皮組織和鼻咽低分化鱗狀細胞癌中表達升高，見圖3，提示LMP1促進鼻咽上皮組織和鼻咽低分化鱗狀細胞癌組織中RPLP0蛋白的表達。

4 p27和RPLP0蛋白表達與鼻咽癌臨床病理的關系

p27和 RPLP0蛋白表達與鼻咽癌患者年齡、LMP1蛋白的表達、淋巴結轉移及TNM分期有關(P＜0.05)，其中患者年齡小、LMP1蛋白的表達陰性、無淋巴結轉移、TNM分期I和II期時，p27蛋白表達陽性率相對較高，而RPLP0蛋白表達則與之相反(P＜0.05);另外2種蛋白表達均與患者性別無關(P＞0.05)，見表1。

Figure4.The expression of RPLP0 protein in nasopharyngeal epithelial(A，B)and nasopharyngeal poorly－differentiated squamouscell carcinoma(C，D)tissues(SP，×400).A，C:LMP1－negative expression;B，D:LMP1 －positive expression.圖4 RPLP0蛋白在鼻咽上皮和鼻咽低分化鱗狀細胞癌組織中的表達

表1 p27和RPLP0蛋白表達在鼻咽癌中的臨床病理學分析Table1.Clinical pathology analysis of the expression of p27 and RPLP0 proteins in nasopharyngeal poorly－differentiated squamouscell carcinoma tissue

討 論

鼻咽癌是我國南方地區如廣東、廣西、湖南和香港等常見的惡性腫瘤之一，其發生涉及遺傳、EB病毒感染、飲食及地理等諸多因素，是一個多基因、多途徑和多階段的復雜生物學過程，屬多基因遺傳性疾病[1－2]。為揭示EB病毒在鼻咽癌發生發展中的作用機制，我們前期選取EB病毒編碼的重要致瘤蛋白LMP1進行了相關研究，采用蛋白質組學方法，篩選獲得包括p27與RPLP0蛋白等在內的39個LMP1調節的蛋白質[5]。為了進一步證實LMP1在鼻咽上皮與鼻咽癌組織中對上述蛋白表達的影響，我們選取其中2個腫瘤相關且表達差異最大的蛋白p27和RPLP0，檢測了它們分別在鼻咽上皮和鼻咽癌組織中的表達情況，并分析與LMP1表達的相關性，為闡明LMP1在鼻咽癌發生、發展中的作用機制提供了實驗依據。

p27蛋白是一種廣譜細胞周期依賴性蛋白激酶(cyclin－dependent kinase，CDK)抑制劑，屬于細胞周期負性調節因子CDKI家族成員之一，通過抑制cyclin/CDK復合物的活性，阻止Rb磷酸化，使細胞周期停滯于G1期，抑制細胞增殖，在真核細胞周期調控中起到重要作用[6－7]。至今，已經在多種腫瘤中檢測到p27表達下降或者缺失，如口腔鱗狀細胞癌[8]、淋巴瘤[9]、前列腺癌[10]和乳腺癌[11]等，提示p27表達的降低可能與腫瘤的發生、發展有關。我們在鼻咽上皮組織與鼻咽低分化鱗狀細胞癌中檢測發現，LMP1表達后細胞中p27蛋白表達降低，結果提示LMP1可能參與抑制p27蛋白的表達。LMP1作為EB病毒編碼的重要致瘤蛋白，通過多條信號轉導途徑參與促細胞的增殖，及誘導細胞惡變[12－13]。因此，我們推測LMP1抑制p27蛋白的表達可能在發揮其致瘤過程中起一定的作用。另外，我們分析了解到患者年齡小、LMP1(－)、無淋巴結轉移、TNM I期和II期時，p27蛋白表達陽性率相對較高，結果說明p27蛋白的表達與鼻咽癌的發生發展及轉移有一定的關系，我們推測LMP1可能通過抑制該蛋白的表達促進鼻咽癌的轉移，但具體分子機制有待后續繼續深入。

RPLP0作為核糖體大亞基上的一個重要組成部分，參與調節蛋白質的合成過程，是維持核糖體穩定性和活性必不可少的[14]。完整的RPLP0蛋白是保持細胞活性所必需的，其參與蛋白合成延伸階段的調節作用，在蛋白翻譯的延伸階段有利于mRNA的移動和脫酰tRNA的移開。當其缺失后可導致60S rRNA 組裝嚴重不足，最終導致細胞死亡[15－16]。我們檢測發現，LMP1在鼻咽上皮細胞和鼻咽低分化鱗狀細胞癌中表達，RPLP0蛋白表達增加，推測LMP1促進細胞增殖，調節細胞內RPLP0蛋白的表達，穩定并增強核糖體蛋白的功能，促進細胞內蛋白質的合成，為細胞的分裂與增殖提供必需的物質基礎，但其中可能的調節機制需我們進一步深入研究。另外，我們觀察到鼻咽癌發生淋巴結轉移和晚期患者中RPLP0蛋白表達陽性率高，提示該蛋白有望成為評估患者分期與預后的檢測指標之一，由于樣本量有限，臨床應用前仍有待大樣本的進一步分析證實。

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