人肝癌細胞系MHCC-97H干細胞體外培養及其生物學行為觀察

(無錫市第三人民醫院，江蘇無錫 214000)

據美國衛生部門統計顯示，因肝癌而死亡的人數位居腫瘤導致死亡人數的第二位。肝癌的早期癥狀不明顯［1，2］，因此尋找特異性的腫瘤表面標志及分子靶點具有非常重要的意義。腫瘤干細胞被認為是腫瘤始動、復發、轉移、耐藥的罪魁禍首。自2011年初至今，我們檢測了肝癌干細胞及肝癌普通細胞相關標志物的表達差異，探討肝癌干細胞的生物學行為特點，旨在為其鑒定分選及其生物學特征的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細胞系細胞株MHCC-97H(購自中科院上海細胞庫)，細胞培養試劑DMEM-F12培養基及胰蛋白酶(購自美國Thremo Fisher公司)，小鼠抗人 CD133Ig，小鼠抗人 Ki67Ig，小鼠抗人MMP9Ig，小鼠抗人MDR1Ig(購自武漢博士德生物工程有限公司)。熒光顯微鏡。

1.2 細胞培養體系 ①普通培養體系:將MHCC-97H細胞培養于含l0%胎牛血清的DMEM-F12培養基中。②干細胞克隆增殖體系:培養于普通培養體系中的MHCC-97H細胞經磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2遍，將其培養于含10 μg/L堿性成纖維生長因子(bFGF)、20 μg/L 表皮生長因子(EGF)、5 μg/L 胰島素、2.75 g/L 轉鐵蛋白、2.75 μg/L 硒的無血清DMEM-F12培養基中，每10天換液1次。將相同來源的MHCC-97H細胞系分別培養于兩種培養體系中，放人含5%CO2的37℃恒溫培養箱，2 d換液1次。

1.3 觀察項目

1.3.1 細胞生長狀況及腫瘤細胞表面標志物表達采用免疫熒光法測定。取肝癌干細胞球及對數期肝癌細胞，分別接種于含有5 mL相應培養體系的24孔板中，培養12 h;4%多聚甲醛溶液常溫下固定細胞克隆1 h;棄固定液，用PBS漂洗3次，每次15 min;用封閉液于37℃下封閉l h;棄廢液，用PBST(0.02 mol/L的PBS中加入0.02%Triton100)漂洗3次，每次15 min;棄廢液，加入一抗，37℃下孵育1 h;棄廢液，用PBST漂洗3次，每次15 min;棄廢液，加入FITC標記二抗孵育2 h及Hoechst 33342，37℃下避光孵育30 min;棄廢液，用PBST避光漂洗3次，每次10 min;50%丙三醇封片。熒光顯微鏡觀察細胞生長狀況及細胞表面蛋白CD133、細胞核相關抗原(Ki67)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、多藥耐藥蛋白1(MDR1)表達。

1.3.2 腫瘤細胞內相關蛋白表達 采用Westernblot法測定。收集培養10 d的兩組細胞，放入裂解緩沖液中裂解，用Lowry法測定蛋白質含量，電泳后將PAGE凝膠中的蛋白質電轉移至硝酸纖維素膜上，取出后將膜放入3%BSA阻斷緩沖液中，封閉60 min，TBS洗 3次，將膜放入一抗中(1∶500稀釋)，4℃過夜。TTBS洗3次，將膜放入二抗(1∶500稀釋)中，室溫孵育1～2 h，用TTBS洗3次，最后用TBS洗膜1次，放入NBT/BC IP顯色液中避光顯色，直至染色出現，終止反應。將蛋白印跡顯影圖掃描，利用凝膠自動分析成像軟件，對蛋白帶進行灰度值分析。以上試驗步驟重復3次。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件行統計學處理。組間比較采用獨立樣本t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MHCC-97H生長狀況 干細胞克隆增殖體系中部分細胞不增殖，大部分細胞增殖為半貼壁的細胞球(圖-1A)，隨著培養天數增加，懸浮細胞球體積逐漸增大，經胰酶消化為單細胞后可再次形成細胞球。在普通培養體系中，細胞貼壁生長(圖-1B)。

2.2 細胞表面相關蛋白表達 腫瘤干細胞表面高表達 CD133、MDR1、MMP9，而普通細胞表面未見CD133、MDR1表達，MMP9呈弱表達。肝癌干細胞及普通細胞表面Ki67均呈強表達，干細胞Ki67表達強于普通細胞(圖2)。

圖1 肝癌干細胞與普通細胞的生長形態

圖2 肝癌干細胞和普通細胞表面相關蛋白表達(免疫熒光法)

2.3 細胞內相關蛋白表達 肝癌干細胞中CD133、MMP9、MDR1呈高表達，普通肝癌細胞中未見表達，兩組比較有顯著性差異，P＜0.05。Ki67在兩種細胞內均有表達，普通肝癌細胞表達量高于肝癌細胞，但無顯著性差異。

圖3 肝癌干細胞與普通細胞內相關蛋白表達(Western-blot法)

3 討論

近年來研究顯示，腫瘤組織中存在一群少量的腫瘤干細胞(在血液系統惡性腫瘤和某些實體瘤中已得到證實)［3］。該群細胞具有自我復制，對放療和化療耐受等特征，被認為是腫瘤生長、轉移、復發和耐藥的基礎［4］;可能是導致肝癌早期診斷率低，復發率高，耐藥性強的最終原因。

目前分離腫瘤干細胞通常采用側群細胞分選法、流式細胞分選法及無血清懸浮培養法［5］。本研究采用無血清懸浮培養法從肝癌細胞MHCC-97H系中分離出干細胞，該群細胞呈懸浮半貼壁生長，且體外連續傳代10代始終能保持成球的特征;當轉換成血清培養時，干細胞球細胞能貼壁生長。據報道，CD133是腫瘤干細胞的表面標志物［6］，本研究中腫瘤干細胞表面CD133呈高表達，既證實該種蛋白可作為肝癌干細胞分選的標志物，亦證實本研究無血清培養的細胞球為肝癌干細胞。

MDR1是一種包括1280個氨基酸，相對分子質量為17000的跨膜磷脂糖蛋白，具有能量依賴性藥泵作用。其功能是能主動將進入細胞內化療藥物逆濃度泵出細胞，降低細胞毒性，并使細胞內有效化療藥物濃度下降，從而導致耐藥。MDR1介導的腫瘤耐藥是化療失敗的主要原因之一。MDR1在白血病干細胞上的表達已有大量報道［7］。但在肝癌細胞是否表達鮮見報道。本研究顯示MDR1在肝癌干細胞呈高表達，而在肝癌非干細胞未見表達，因此筆者認為，肝癌干細胞表達的MDR1是介導肝癌發生耐藥的主要機制之一;作為肝癌干細胞的特異性膜表達蛋白，MDR1可作為腫瘤干細胞分選的分子標志之一。

MMP9是MMP中分子量最大的酶，存在于細胞質內，以酶原的形式分泌。其分泌到胞外后一方面降解、破壞靠近腫瘤表面的細胞外基質和血管壁的基底膜，促進腫瘤侵襲和轉移;另一方面通過毛細血管內生、新生血管生成促進腫瘤侵襲和轉移。MMP是高度保守的一類酶，可特異性的降解腫瘤細胞外基質中的蛋白質，是腫瘤細胞向瘤灶周圍侵襲性生長的關鍵酶［8］。本研究發現MMP9在肝癌干細胞內呈高表達，而肝癌非干細胞未見明顯表達，據此推測，其介導肝癌轉移的主要原因是肝癌干細胞分泌MMP9;激活的MMP9通過降解細胞外基質和血管壁的基底膜，從而促進腫瘤的浸潤、轉移。其詳細機制有待進一步研究。

Ki67是一種與增殖細胞相關的核抗原，與細胞的有絲分裂有關，其存在于細胞周期G1后期及S、G2、M期，與細胞的增殖高度有關［9］。本研究發現，肝癌干細胞及非干細胞內均存在Ki67高表達，說明這兩種細胞都具有很強的增殖能力。

總之，肝癌組織中存在著一群腫瘤干細胞，該群細胞是介導腫瘤發生耐藥、轉移、增殖的主導因素。MDR1為肝癌干細胞的特異性細胞表面抗原，可作為其分選、簽定的有效分子標志物。聯合多種指標簽定、篩選出的肝癌干細胞將對惡性程度極高的腫瘤的治療產生影響。

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