秦皮乙素對人肝癌HepG2細胞體外增殖的影響及機制探討

(遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州 121000)

秦皮是具有很大開發利用價值的地道中藥材，其主要成分為香豆素類化合物，其中秦皮乙素在秦皮中含量為0.126% ～1.738%［1］。研究發現，秦皮乙秦在體外對A549肺癌細胞、黑色素瘤細胞、人T淋巴細胞性白血病細胞以及人胃癌細胞等均有抑制作用，可促進HL-60細胞凋亡;其在體內外對鼠類的巨噬細胞和淋巴細胞的免疫調節作用可能是其體內抗腫瘤的作用機制之一［2］。我們前期研究發現，秦皮乙素對人肝癌細胞SMMC-7721有促凋亡作用，但其對人肝癌HepG2細胞體外增殖的作用鮮見報道。2010～2011年，我們觀察了秦皮乙素對人肝癌細胞HepG2體外增殖的影響，旨在為該藥進一步的開發研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌HepG2細胞(遼寧醫學院科學實驗中心)。秦皮乙素(中國藥品生物制品鑒定所，批號:110741-200506)，5-氟脲嘧啶(5-Fu，天津金耀氨基酸藥業，10 mL:0.25 g，批號:20101205)。兔抗人Bax抗體(SANTA CRUZ公司，型號:SC-526)，兔抗人 Bcl-2抗體(SANTA CRUZ公司，型號:SC-429)。兔抗人Caspase-9抗體(博奧森公司，型號:BS-0049R)。兔抗人Caspase-3抗體(博奧森公司，型號:BS-0081R)。Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9活性檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所);線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1，碧云天生物技術研究所);Annexin V-FITC凋亡試劑盒(北京寶賽生物公司);胰蛋白酶(Hyclone公司);小牛血清(杭州四季清生物制品公司);DMEM培養基干粉(GIBCO公司);四甲基偶氮唑藍(Amresco公司)。其他試劑為國產分析純。熒光顯微鏡(LEICACTR4000，德國)，XD-101型倒置顯微鏡(OLYMPUS TOKYO JAPAN)，流式細胞儀(BD FACSCaLibur)，YG-875B無菌超凈工作臺(上海醫療器械廠)，CO2培養箱(Sheldon Manufacturing IncUSA)，酶標儀(9602A，北京普朗)，IBO X600活體成像系統(USA)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 人肝癌細胞 HepG2培養于含15%小牛血清的DMEM高糖培養液中，37℃，5%CO2傳代培養，每2～3天換液1次，取對數生長期細胞按每孔1×104個接種于96孔板，分為對照組、5-Fu組及秦皮乙素組。

1.2.2 細胞干預及細胞增殖抑制率檢測對照組不干預，5-Fu組予0.77 mmol/L的5-Fu干預，秦皮乙素組分別予 0.56 、1.12、2.24、4.48、8.96 mmol/L 的秦皮乙素干預［3］，每組5個平行復孔。干預后培養24 h。細胞增殖抑制率檢測采用MTT比色法，測定490 nm波長處吸光度值(OD值)。細胞增殖抑制率=(1－實驗組OD值/陰性對照組OD值)×100%。

1.2.3 細胞干預及細胞凋亡率檢測 對照組不干預，5-Fu組予濃度為0.77 mmol/L的5-Fu干預，秦皮乙素組分別予2.24、4.48 mmol/L的秦皮乙素干預。干預后培養24 h，0.25%胰酶消化、收集細胞后1 000 g離心5 min，加入195 μL Annexinv-FITC 結合液重懸細胞，加入10 μL碘化丙啶染色液輕輕混勻，冰浴避光放置。流式細胞儀Bioconsort專用軟件處理計算細胞凋亡率［3］。

1.2.4 細胞干預及線粒體膜電位檢測 對照組不干預，5-Fu組予濃度為0.77 mmol/L的5-Fu干預，秦皮乙素組分別用 1.12、2.24、4.48 mmol/L 的秦皮乙素干預。干預后培養24 h，流式細胞儀綠色熒光法測定細胞百分率，即線粒體膜電位［4］。

1.2.5 細胞干預及Caspase酶活性檢測 細胞干預同1.2.4，分光光度法檢測Caspase酶活性。收集細胞后600 g、4℃離心5 min，小心吸除上清，PBS洗滌1次。冰浴裂解細胞15 min。96孔板中每孔加入檢測緩沖液 60 μL，待測樣品30 μL，底物 Ac-IETD-ρNA10 6 mL，37 ℃孵育 3 h，405 nm 處測定樣品吸光值，樣品吸光值減去對照組吸光值即為樣品中Caspase催化產生ρNA的吸光度值。通過標準曲線計算 Caspase 3、Caspase 8，Caspase 9 活性［5］。ρNA標準曲線制定:按照40 μL裂解液加入60 μL檢測緩沖液的比例配制標準品稀釋液，將標準品稀釋為 0、10、20、50、100、200 μmol/L，每個濃度取 100 μL用酶標儀進行檢測，每個標準品的A405減去不含ρNA的空白對照的A405，計算出實際因ρNA而導致的吸光度，并制作出ρNA濃度相當于A405的標準曲線。

1.2.6 細胞干預及 Bax、Bcl-2、Caspase-9 蛋白表達測定 蓋玻片先行防脫片處理(二甲苯12 h，丙酮3 h，無水乙醇24 h，70%乙醇30 min，雙蒸水煮1 h);載玻片事先泡酸24 h;六孔板做細胞爬片。細胞分組及干預同1.2.3。干預后培養48 h，10%福爾馬林固定30 min，PBS洗3次，30%H2O2和甲醇混合，室溫浸泡15 min，蒸餾水洗3次，滴加3%BSA封閉液25 min，加入1∶500稀釋的一抗，4℃過夜。加入1∶200稀釋的二抗，37℃避光孵育20 min，封片。免疫熒光法檢測Bax、Bcl-2、Caspase-9蛋白表達:采用Image Pro Plus軟件進行處理分析，自動計算出平均熒光強度。計算公式:圖片的像素面積(像素)×圖片平均光密度(光強度/像素)/AOI像素面積(像素)。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件行統計學處理。計量資料以±s表示，行t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖抑制率 各組細胞增殖抑制率比較見表1。

表1 各組細胞增殖抑制率比較(n=5，±s)

表1 各組細胞增殖抑制率比較(n=5，±s)

注:與對照組比較，★P ＜0.05，△P ＜0.01

組別 OD值 抑制率(%)5-Fu 組 0.512 ±0.09★37秦皮乙素組0.56 mmol/L 0.715 ±0.11★ 12 1.12 mmol/L 0.577 ±0.04★ 29 2.24 mmol/L 0.463 ±0.18△ 43 4.48 mmol/L 0.358 ±0.12△ 56 8.96 mmol/L 0.252 ±0.06△ 69對照組0.813 ±0.16 0

2.2 細胞凋亡率 各組細胞凋亡率比較見表2。

2.3 線粒體膜電位 各組細胞膜電位比較見表3。由表3可見，隨秦皮乙素作用濃度增加，HepG2細胞線粒體膜電位下降，呈濃度依賴性。

2.4 Caspase酶活性 不同濃度秦皮乙素處理24 h后，Caspase 3、Caspase 9活性增高，Caspase 8活性無明顯變化。ρNA濃度相當于 A405的標準曲線:Caspase 3:Y=0.0051X+0.0484，R2=0.9948;Caspase 8:Y=0.0034X+0.0374，R2=0.99434;Caspase 9:Y=0.0037X+0.03，R2=0.9905。

表2 各組細胞凋亡率比較(n=5，%，±s)

表2 各組細胞凋亡率比較(n=5，%，±s)

注:與對照組比較，★P ＜0.01

組別 凋亡率5-Fu 組 15.24 ±0.41★秦皮乙素組2.24 mmol/L 17.39 ±0.67★4.48 mmol/L 26.12 ±0.59★對照組1.15 ±0.052

表3 各組細胞膜電位比較(n=5，%，±s)

表3 各組細胞膜電位比較(n=5，%，±s)

注:與對照組比較，★P ＜0.01

組別 線粒體膜電位5-Fu 組 21.37 ±0.28★秦皮乙素組1.12 mmol/L 15.76 ±0.71★2.24 mmol/L 34.92 ±0.34★4.48 mmol/L 46.32 ±0.21★對照組0.09 ±0.04

2.5 Bax、Bcl-2、Caspase-9蛋白表達 見表4。

表 4 各組 Bax、Bcl-2、Caspase-9 蛋白表達(n=5， ±s)

表 4 各組 Bax、Bcl-2、Caspase-9 蛋白表達(n=5， ±s)

注:與對照組比較，★P ＜0.01;與2.24 mmol/L 比較，△P ＜0.05

組別Bax Bcl-2 Caspase-9 5-Fu 組 117.62 ±5.16★ 96.15 ±3.86★ 100.67 ±2.48★秦皮乙素組2.24 mmol/L 139.71 ±10.52★ 110.9 ±8.76★ 124.57 ±6.14★4.48 mmol/L 165.67 ±3.74★△ 98.27 ±3.94★△ 145.61 ±3.95★△對照組83.14 ±3.25 159.21 ±5.48 63.01 ±5.14

3 討論

中藥誘導肝癌細胞凋亡是一個新興的課題，揭示其作用機制、篩選抗腫瘤新藥為當前研究熱點。

細胞凋亡(程序性細胞死亡)途徑有膜受體通路和線粒體通路，它們之間既相互聯系又相對獨立，Caspase等蛋白酶水解系統是凋亡過程的核心。膜受體通路可形成凋亡誘導復合物，引起Caspase-8聚集，再作用于Caspase-3引起細胞凋亡;線粒體通路為線粒體膜電位改變，可釋放細胞色素C，激活Caspase-9及Caspase-3引起細胞凋亡。線粒體膜電位降低是細胞凋亡過程中的首要事件，一旦線粒體跨膜電位發生變化，細胞凋亡將不可逆轉。在線粒體凋亡通路中，線粒體是細胞凋亡的關鍵元件，線粒體膜的完整性由線粒體跨膜電位來維持，跨膜電位降低時，膜的通透性改變，引起細胞凋亡。本研究結果證實，秦皮乙素可抑制人肝癌HepG2細胞增殖，導致線粒體膜電位下降，呈劑量依賴性;表明秦皮乙素可能通過線粒體途徑誘導人肝癌 HepG2 細胞凋亡［6～8］。

Caspase-9和Caspase-3是線粒體凋亡通路中兩個重要的Caspase分子。Caspase-9是線粒體凋亡通路中上游凋亡起始的重要信號分子，活化的Caspase-9激活其下游的Caspase-3，而對Caspase-8無激活作用。Caspase-3活性增高繼而引起Caspase級聯反應，啟動線粒體途徑誘導細胞凋亡。本研究分光光度法檢測結果顯示，秦皮乙素作用24 h后，Caspase-9和Caspase-3活性增高，而Caspase-8的活性無明顯變化;免疫熒光法結果顯示，Caspase-9表達增強。進一步證實秦皮乙素可能通過線粒體途徑誘導人肝癌HepG2細胞凋亡［9］。

Bax和Bcl-2是細胞凋亡過程中兩個重要的凋亡調控因子。Bax主要分布于線粒體外膜上，其過表達可誘導細胞凋亡;Bcl-2是抗凋亡因子，當Bax表達量高時，形成同源二聚體Bax/Bax，抑制Bcl-2的抗凋亡作用從而誘導細胞凋亡。本研究結果顯示，Bax表達增強的同時 Bcl-2的表達明顯減弱［10，11］。

分析本研究結果，秦皮乙素可能通過線粒體途徑誘導人肝癌HepG2細胞凋亡。但尚需通過進一步研究驗證下述問題:在 Caspase-9抑制劑或Caspase-3抑制劑的作用下細胞是否仍然會發生凋亡;秦皮乙素誘導細胞凋亡是否還有其它途徑;秦皮乙素對其它信號通路和癌基因、抑癌基因是否有影響等。

［1］汪國松，楊亞濱，李璠等.秦皮的研究進展［J］.國外醫藥.植物藥分冊，2007，22(3):108-111.

［2］方蓮花，呂揚，杜冠華.秦皮的藥理作用研究進展［J］.中國中藥雜志，2008，33(23):2732-2736.

［3］王晶，王洪新，李紅玉.秦皮乙素的制備及對人肝癌細胞SMMC-7721體外增殖的影響［J］.中國現代應用藥學，2009，26(6):439-442.

［4］葉艷清，李國平，蒲澤錦，等.腺苷通過內質網應激途徑誘導HepG2細胞凋亡的研究［J］中國藥理學通報，2010，26(5):596-601.

［5］林箐，彭華毅.黃葵素.誘導小鼠黑色素瘤B-16細胞凋亡的研究［J］，中國藥理學通報，2010，26(12):1630-1634.

［6］張瓊，劉德育.蛇葡萄素改變Bcl-2/Bax表達和激活Caspase-3誘導人肝癌細胞 Bel-7402凋亡［J］.中國藥理學通報，2009，25(11):1502-1506.

［7］曲佳，郭坤元，吳秉毅等.冬凌草甲素誘導人多發性骨髓瘤ARH-77凋亡及其可能機制［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2010，17(2):134-138.

［8］史海嶺，劉芬，郭曉軍，等.黃連素對肺腺癌A549細胞增殖、遷移與黏附的影響［J］.中國癌癥雜志，2009，19(12):910-914.

［9］宋少華，郭聞淵，傅志仁，等.丹參多酚酸鹽通過線粒體途徑誘導人肝癌SMMC-7721細胞的凋亡［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2010，17(1):62-66.

［10］賈永清，滕熔，胡慧仙.亞硒酸鈉對HL-60細胞增殖、凋亡影響及作用機制探討［J］.交通醫學，2011，25(2):121-125.

［11］李澤良，劉同才，孫志熙，等.MMP2，MMP9在腎癌中的表達及意義［J］.中國醫科大學學報，2001，30(4):299-306.