通用黏膜免疫佐劑的制備

李志會，李 鵬，岳盈盈，宋楠楠，紀 璇，曹銀光，孟 紅

(1山東省醫學科學院基礎醫學研究所，山東省罕少見病重點實驗室，濟南 250062;2聊城市人民醫院)

研究表明黏膜接種是敏感、有效、簡便、安全的免疫途徑，但黏膜途徑用藥存在免疫原性差、在低pH和腸道酶作用下會發生降解、口服吸收率低，單獨使用無法產生有效的免疫保護反應等缺點，因此尋找高效、安全、適宜的黏膜佐劑成為黏膜疫苗研發中的關鍵問題。2010年5月至2011年7月，我們采用同源重組技術制備通用黏膜免疫佐劑，旨在解決當前黏膜途徑免疫缺乏安全有效免疫佐劑的問題。

1 材料與方法

1.1 材料 質粒pDG1662和枯草芽胞桿菌1A771購自Ohio公司，pET30a-SPA質粒由山東省罕少見病重點實驗室構建并保存［1］，克隆載體pMD18-T和pfu DNA聚合酶購自大連寶生物工程有限公司，DNA凝膠回收試劑盒與質粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，限制性內切酶購自立陶宛Fermentas公司，人源免疫球蛋白IgG購自北京索萊寶科技有限公司，異硫氰酸酯熒光素標記兔抗人IgG購自武漢博士德生物工程有限公司，化學試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 通用黏膜免疫佐劑制備方法

1.2.1 AB融合基因構建 根據葡萄球菌A蛋白(SPA)A功能域基因序列用Primer Premier 5.0軟件設計引物:A1:5'AAGCTTGGTGAAGCTCAAAAACTTAATGACT-3';A2:5'CTCGAGTAAAACGTTAGTGCTTTGGCTT-3'(目的片段長189 bp，斜體為酶切位點)。鏈球菌G蛋白(StreptococcalProteinG，SPG)B2功能域全長178 bp，由上海博亞生物有限公司合成，前后分別引入XhoⅠ/BamHⅠ酶切位點，PCR鑒定SPG引物序列:G1:5'ACTTACAAACTTGTTATTAATGGTCT-3';G2:5'TTCA GTTACCGTAAAGGTCTTAGT-3'。引物均由上海博亞生物有限公司合成。以pET30a-SPA質粒［2］為模板，A1/A2為引物調取A功能域，1.0%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段，測序正確后提取質粒雙酶切與SPG B2功能域連接并測序。

1.2.2 pDG1662-CotB質粒構建 根據枯草芽胞桿菌芽胞衣蛋白CotB基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設計引物如下:B1:5'-GAATTCGAATCCGAGTTTCGCAAGTCCT-3';B2:5'-AAGCTTGATGATT GATCATCTGAAGAT-3'(目的片段長1 305 bp，包含CotB的啟動子及部分編碼序列，斜體為酶切位點)，由上海博亞生物有限公司合成。以枯草芽胞桿菌1A771基因組為模板調取目的基因。擴增產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，DNA凝膠回收目的片段，將上述目的片段連接到pMD18-T載體得到質粒pMD18-CotB進行測序，測序正確后EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切連接到同樣雙酶切的pDG1662質粒。

1.2.3 pDG1662-CotB-AB 質粒構建 測序正確的質粒 pUC57-AB、pDG1662-CotB分別用 HindⅢ/BamHⅠ雙酶切，回收目的片段并連接得到質粒pDG1662-CotB-AB，將所得質粒分別用BamHⅠ/XhoⅠ、XhoⅠ/HindⅢ、EcoRⅠ/HindⅢ、HindⅢ/BamHⅠ及EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定。

1.2.4 質粒轉化 挑取一環菌液接種于5 mL生長培養基中，過夜培養種子液。將種子接種于80 mL生長培養基中，37℃搖床震蕩培養3 h。冰水浴冷卻培養物10 min，4℃、5 000 g，離心5 min收集菌體。反復用冰冷的電擊緩沖液洗滌細胞4次。用2 mL的電擊緩沖液重新懸浮細胞收集物，即為枯草芽胞桿菌感受態細胞。將提取的質粒pDG1662-CotBAB用NdeⅠ酶切線性化后加入到感受態細胞混勻并轉移到冰冷的電轉化杯中，冰浴1.5 min。1 800 V電擊2次后，立即加入1 mL復蘇培養基。37℃搖床震蕩培養3 h后，將復蘇物涂布在氯霉素抗LB平板上，37℃培養。

1.2.5 重組菌篩選 于轉化后的氯霉素抗性LB平板上挑取單菌落，氯霉素抗性LB培養基37℃搖床震蕩培養過夜，將菌液1∶100接種于紅霉素抗性LB培養基中，37℃搖床震蕩培養過夜。對紅霉素敏感而抗氯霉素的菌株為正確重組菌株。

1.2.6 重組菌鑒定 ①PCR法:取一環菌液接種到10 mL氯霉素抗性LB液體培養基中，37℃搖床震蕩培養過夜，8 000 g離心5 min收集菌體，用pH 7.0的PBS緩沖液重懸菌體后加入終濃度1 mg/mL的溶菌酶，混勻37℃孵育40 min，8 000 g離心5 min收集菌體，TE緩沖液重懸后加終濃度50 mg/mL蛋白酶K及1%SDS，37℃水浴2 h，加等體積的中性酚/氯仿，振蕩30 s，12 000 g離心5 min，上清加1/10體積的3M醋酸鈉溶液和等體積的異丙醇，混勻。室溫放置5 min，12 000 g離心5 min，沉淀物用70%乙醇洗2遍，干燥后溶于TE緩沖液即為基因組溶液，野生菌株做同樣處理。以基因組為模版，以 B1-B2、A1-G2、B1-G2為引物，PCR擴增產物1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。②免疫熒光法:重組菌置于氯霉素抗性LB液體培養基中37℃搖床震蕩培養48 h后于室溫靜置24 h使芽胞充分生成，12 000 g離心5 min收集芽胞，將收集的芽胞用PBS洗3次，與人源免疫球蛋白IgG于37℃搖床輕微震蕩共孵育1 h，PBST洗芽胞3次，PBS重懸芽胞與FITC標記兔抗人IgG，37℃搖床輕微震蕩共孵育1 h，PBST洗芽胞3次后涂玻片，野生菌株做同樣處理，于熒光顯微鏡下觀察結果。

2 結果

2.1 AB融合基因構建 PCR產物電泳顯示大小約為189 bp處有陽性條帶(圖1)，與預期一致，表明成功調取SPA的A功能域。將目的片段與連接到合成的SPG的B2功能域上游后測序正確，從而得到質粒pUC-AB。

2.2 CotB目的基因調取 PCR產物電泳顯示大小約為1 305 bp(圖2)處出現陽性條帶，與預期一致，表明成功調取CotB基因，將目的片段連接到pMD18-T載體后測序正確，從而得到質粒pMD18-CotB。

2.3 重組質粒構建 質粒pMD18-CotB和pUC57-AB分別用EcoRⅠ/HindⅢ及HindⅢ/BamHⅠ雙酶切得到目的片段CotB及AB，順序插入pDG1662中得到pDG1662-CotB-AB質粒。pDG1662-CotB-AB質粒用 BamHⅠ/XhoⅠ、XhoⅠ/HindⅢ、EcoRⅠ/HindⅢ、HindⅢ/BamHⅠ及EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切產物電泳在 189 bp、178 bp、1 305 bp、367 bp、1 672 bp大小出現目的條帶(圖3)，與預期一致，表明已成功將CotB和AB基因融合構建到質粒pDG1662中。

2.4 重組菌鑒定 PCR法結果顯示，電泳出現約1 305 bp、367 bp、1 672 bp 大小的目的片段(圖 4)，表明AB融合基因成功重組到枯草芽胞桿菌基因組中。免疫熒光法顯示人、小鼠源IgG組重組菌出現強熒光信號，而對照菌無綠色熒光出現，表明IBP功能域成功展示在芽胞表面，并且能與人源免疫球蛋白特異結合，具有良好的生物活性。

圖1 SPA的A片段調取電泳圖

圖2 CotB片段調取電泳圖

圖3 重組質粒雙酶切電泳圖

圖4 pDG1662-CotB-AB質粒PCR鑒定電泳圖

3 討論

疫苗接種在感染性疾病的防控中發揮著舉足輕重的作用，而黏膜途徑接種疫苗具有無創傷、無毒副作用等優點，成為當前的研究熱點。Mauriello等［3］采用CotC為融合表達載體蛋白展示了TTFC及LT，用黏膜途徑免疫小鼠誘導了全身及黏膜特異性抗體;Duc等［4］對枯草芽胞桿菌芽胞的免疫特性以及在細胞內的歸宿研究顯示，芽胞可誘導機體產生局部免疫和系統免疫反應，該課題組以CotB-TTFc重組芽胞口服、鼻腔免疫小鼠，證實小鼠能產生特異性抗體，可抵抗致死劑量破傷風毒素的攻擊。有學者采用痢疾菌苗經滴鼻途徑免疫小鼠，發現能有效激發鼻黏膜局部分泌抗原特異性IgA、IgG升高，可誘發遠離免疫誘導部位的胃腸黏膜和生殖道黏膜分泌抗原特異性IgA、IgG升高及血清中抗原特異性IgA、IgG升高，表明共同黏膜免疫系統的存在［5］，同時說明鼻黏膜是敏感有效、簡便安全的免疫途徑。大量研究發現枯草芽胞桿菌芽胞能誘導機體產生特異性局部免疫和系統免疫反應，表明枯草芽胞桿菌芽胞是黏膜免疫的一個有效載體;另有研究顯示，芽胞表面展示抗原比芽胞萌時展示的抗原誘導能力更加有效［6］。

本研究從前期構建的pET30a-SPA質粒中調取A功能域，全序列合成SPG B2功能域，并將兩者連接后與枯草芽胞桿菌芽胞衣蛋白CotB基因連接插入整合質粒pDG1662，通過同源重組將CotB-AB基因整合入枯草芽胞桿菌基因組，進而將免疫球蛋白結合蛋白(IBP)功能域展示在枯草芽胞桿菌芽胞表面，經抗生素抗性篩選后提取基因組，以基因組為模板經PCR鑒定表明AB融合基因成功重組到枯草芽胞桿菌基因組中。免疫熒光試驗中人源免疫球蛋白IgG組具有明顯的熒光信號，而對照組無熒光，說明該IBP融合功能域成功在芽胞表面表達，且具有與人源免疫球蛋白IgG的親和活性。本研究成功制備了通用黏膜免疫佐劑奠定了基礎，且在IgG純化中具有一定的應用前景及價值。

［1］岳盈盈，李志會，李鵬，等.腸道病毒71型結構蛋白VP1的原核表達及初步鑒定［J］.山東醫藥，2011，51(7):22-24.

［2］李志會，岳盈盈，李鵬，等.金黃色葡萄球菌蛋白A的原核表達及生物親和特性的研究［J］.山東大學學報(醫學版)，2009，47(10):28-31.

［3］Mauriello EM，Duc lH，Isticato R，et al.Display of heterologous antigens on the Bacillus subtilis spore coat using CotC as a fusion partner［J］.Vaccine，2004，22(9-10):1177-1187.

［4］Due LH，Hong HA，Uyen NQ，et al.Intracellular fate and immunogenicity of B.subtilis spores［J］.Vaccine，2004，22(15-16):1873-1885.

［5］舒翠莉，彭虹，王華，等.滴鼻免疫有效的誘導粘膜及系統免疫反應［J］.微生物學免疫學進展，2001，29(4):40-44.

［6］Uyen NQ，Hong HA，Cutting SM.Enhanced immunisation and expression strategies using bacterial spores as heat-stable vaccine delivery vehicles［J］.Vaccine，2007，25(2):356-365.