翅果油樹葉片中三萜皂苷的提取工藝研究

張曉俊，閆桂琴

(山西師范大學 生命科學學院生物多樣性研究所，山西 臨汾 041004)

翅果油樹(Elaea gnus．mollis．Diels)屬胡頹子科胡頹子屬植物，是第四紀冰川作用后殘存下來的古生植物，為我國特有種，國家二級重點保護植物［1］。主要分布于山西省鄉寧、翼城、平陸等地的低山、丘陵區和陜西秦嶺北麓的戶縣。翅果油樹葉片中富含各種營養成分，是一種優良的野生植物資源，具有重要的開發與應用價值。

三萜皂苷在自然界分布很廣，并且具有廣泛的藥理作用和生物活性，如免疫作用、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、防治心血管疾病等，而且還可以作為食品天然甜味劑、保護劑、發泡劑、增味劑、抗氧化劑等。目前，三萜皂苷已經廣泛應用于藥物和食品方面［2］。

本研究通過單因素及正交試驗考查了浸提法提取翅果油樹葉片中三萜皂苷的主要影響因素，研究了最佳提取工藝條件，期望探索一種快速、簡便、提取率高的提取方法。

1 材料和方法

1.1 植物材料

2010年9月于山西翼城甘泉林場采集翅果油樹葉片，洗凈放置于40℃電熱鼓風干燥箱中烘干，經研磨粉碎后過0.177 mm(80目)篩備用。

1.2 儀器和藥品

1.2.1 主要儀器及設備

高速萬能粉碎機FW100(天津市泰斯儀器有限公司)，電子天平 FA1104(北京賽多利斯儀器系統有限公司)，HH-8數顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司)，D GH-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)，UV-401PC紫外分光光度計(日本島津)。

1.2.2 主要化學及生化試劑

無水乙醇，正丁醇，香草醛，濃硫酸(均為分析純)。

77%硫酸溶液:準確量取蒸餾水21 mL于400 mL燒杯中，緩慢加入98%硫酸溶液79 mL，靜置后倒入容量瓶中，低溫保存。

8%香草醛-無水乙醇溶液:準確稱取香草醛8 g于50 mL燒杯中，加無水乙醇溶解，定容至100 mL，置于棕色瓶中，低溫保存。

標準品溶液的制備(100 μg·mL－1):準確稱取薄層層析得到的三萜皂苷0.025 g，置于100 mL燒杯中，加甲醇使之溶解，定容至250 mL，搖勻密塞，低溫保存。

1.3 方法

稱取2.0 g翅果油樹葉片粉末，用無水乙醇溶液浸提，將提取液進行抽濾，濃縮至浸膏狀，加入25 mL蒸餾水復溶，抽濾，濾液再加入正丁醇進行萃取，萃取至正丁醇層無色為止，合并正丁醇層，濃縮至干。采用香草醛－濃硫酸顯色法測定含量并計算提取率［3］。

提取率/%=三萜皂苷的質量/翅果油樹葉片粉末的質量 ×100。

1.3.1 標準曲線的繪制

準確移取 100 μg·mL－1標準溶液 10 mL，于容量瓶中定容到50 mL，分別取2.00，4.00，6.00，8.00，10.00，12.00 mL于具塞試管中，烘干溶液，加入8%香草醛-無水乙醇液 0.5 mL，1 min后，加入77%硫酸3 mL，搖勻，在75℃恒溫水浴中加熱5 min，冰水浴15 min，移取1 mL于比色管中加入77%硫酸定容到10 mL，搖勻，10 min后采用紫外分光光度計在440 nm處(比色皿厚度為10 mm)測定吸光值。以試劑空白為參比液，繪制標準曲線。

1.3.2 乙醇濃度對提取效果的影響

稱取葉片粉末2.0 g各3份，分別加入30%，45%，60%，75%，90%等濃度不同的乙醇溶液浸提，按1.3的方法得到不同濃度提取劑對提取率的影響。

1.3.3 溫度對提取效果的影響

稱取葉片粉末2.0 g各3份，分別在40℃，50℃，60℃，70℃，80℃不同溫度下浸提，按

1.3 的方法得到不同提取溫度對提取率的影響。

1.3.4 料液比對提取效果的影響

稱取葉片粉末2.0 g各3份，分別用1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 不同的料液比浸提，按 1.3的方法得到不同料液比對提取率的影響。

1.3.5 時間對提取效果的影響

稱取葉片粉末2.0 g各 3份，分別選擇30，60，90，120，150 min不同時間浸提，按1.3的方法得到不同提取時間對提取率的影響。

1.3.6 正交試驗

正交試驗選擇L9(34)正交表，以乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時間為4因素，做3水平的正交試驗。

2 結果和分析

2.1 最大吸收波長的選擇

翅果油樹葉片提取物待測液在波長200～600 nm區間吸光值不明顯，而經香草醛－濃硫酸顯色后有強的吸收峰，最大吸收波長為440 nm，在此位置有明顯的峰形，與標準品溶液顯色后的掃描曲線相似，本法選用440 nm為測定波長［4］。

2.2 標準曲線的繪制

從圖1可以得出以吸光度對三萜皂苷含量求的回歸方程是:y=0.103x+0.048 7，相關系數 r=0.996 4。

2.3 乙醇濃度對提取效果的影響

從圖2可以看出，隨著乙醇濃度的增加，溶液的極性增強，提取率也在增加。乙醇濃度75%時提取率最大，但濃度繼續增加反而會使提取率下降。這主要是由于隨著乙醇-水體積分數的變化，溶劑的極性發生變化，使一些醇溶性雜質、色素等有機成分溶出量增加。根據相似相溶原理，乙醇濃度達到一定程度時，提取率會下降［5］。

圖1 三萜皂苷含量與吸光度的標準曲線

圖2 乙醇濃度對提取率的影響

2.4 提取溫度對提取效果的影響

從圖3中可以看出，隨著溫度的增加，三萜皂苷溶解度不斷增加，但當溫度超過70℃時，提取率反而下降。可能是由于溫度過高超過溶劑沸點后，容易造成溶劑的損失，使提取率下降;同時溫度過高，雜質的溶出量增加，導致提取率下降［6］。

圖3 溫度對提取率的影響

2.5 料液比對提取效果的影響

由圖4知，提取率隨乙醇提取劑用量的增加而升高，整個曲線呈現上升趨勢。當料液比達到1∶25后，增加的幅度較小。

圖4 料液比對提取率的影響

2.6 提取時間對提取效果的影響

由圖5可知，隨著時間增加，提取率也在增加。當浸提時間超過90 min后，提取率下降。這是因為浸提時間過長，使得部分不穩定的皂苷結構可能發生變化，其他大量非皂苷類的成分也在溶出，可能會結合部分皂苷沉淀［7－10］。

圖5 時間對提取率的影響

2.7 正交試驗

L9(34)正交試驗結果(表1)分析可知，在4個因素中，影響翅果油樹葉片中三萜皂苷提取效果的主次順序為A＞B＞D＞C，提取率最高的條件為A2B3C2D3，即乙醇濃度60%，溫度70℃，料液比1∶20，提取時間 120 min。

表1 各處理組合對提取率的影響

3 討論

本實驗以乙醇作為提取溶劑是因為醇提法可以減少藥材中水溶性雜質如淀粉、蛋白質和粘液質的浸出，避免三萜皂苷在水溶液中會起泡沫，這樣會有定量上的誤差。據文獻報道，在醇類提取劑中，甲醇的提取率高于乙醇，但甲醇毒性大，且乙醇提取液不會發霉變質，容易回收利用。因此，綜合各方面因素，采用醇提法，選擇乙醇為提取溶劑。

盡管傳統提取法目前在工業生產中應用普遍，但存在提取時間長，有機溶劑損耗多等缺點［10－16］。在傳統提取基礎上采用超聲波或微波等現代輔助提取技術，雖然能有效提高提取率，縮短時間，降低耗能等，但這些技術尚未能在工業生產中大規模使用，考慮到本實驗將應用于工業生產的情況，本實驗選擇浸提法來進行研究。

4 小結

本實驗以乙醇作為提取溶劑，采用浸提法，研究了影響翅果油樹葉片中三萜皂苷提取率的因素。選擇乙醇濃度、提取溫度、提取時間和料液比，分別作了單因素實驗，并在此基礎上，用正交實驗確定了提取的最佳工藝條件。結果表明，當乙醇濃度60%，溫度70℃，料液比1∶20，提取時間120 min時提取率最高。

［1］王晶利，李君．中藥有效成分提取方法研究進展田［J］．陜西中醫函授，1995(3):23－25．

［2］王曉穎，劉大有，夏忠庭，等．三萜皂苷定性定量分析方法研究進展［J］．中草藥，2002，33(9):861－863．

［3］黃河寧，賴文忠，周文富，等．分光光度法測定茶制品中兒茶素含量的研究［J］．紹興文理學院學報:自然科學版，2003，23(9):25－27．

［4］劉淼．中草藥成分提取分離與制劑加工新技術新工藝新標準實用手冊［M］．北京:中國教育出社，2004:315．

［5］石建輝，王金輝，車東，等．核桃楸樹皮化學成分研究［J］．中藥研究與信息，2005，7(1):7－8．

［6］曾里，曾凡俊，張杰，等．超聲波技術應用于元寶楓黃酮浸提的研究［J］．食品科技，2008(1):163－166．

［7］魏敏，江雪華．正交設計法優選黃茂提取工藝研究［J］．基層中藥雜志，2000，14(6):23－25．

［8］黎海彬，張敏，王邕，等．植物三萜皂苷的提取分離技術［J］．食品工業科技，2006，27(1):201－204．

［9］李敏，費曜，李麗霞，等．天冬中總皂苷含量測定方法的探討［J］．成都中醫藥大學學報，2004，27(4):46－48．

［10］吳洪蘭，李奎平，孟祥學，等．分光光度法測定人參花蕾中總皂苷的含量［J］．時珍國藥研究，1998，9(2):140．

［11］張亞．皂苷類成分的生物樣品測定方法5年來研究狀況［J］．醫學信息，2005，18(6):677－679．

［12］孫光芝，王繼彥，劉志，等．正交試驗優選人參中丙二酰基人參皂苷的提取工藝研究［J］．中草藥，2006，37(8):1194－1195．

［13］周琳，李元波，曾英．超聲酶法提取三七總皂苷的研究［J］．中成藥，2006，28(5):642－645．

［14］王曉娟，朱玲珍．牛膝皂苷的化學成分研究［J］．第四軍醫大學學報，2000，17(6):427－430．

［15］斯建勇，陳迪華．羅漢果中三萜皂苷的分離和結構鑒定［J］．植物學報，1996，38(6):489－499．

［16］婁紅祥，郎偉君．金銀花水溶性化合物的分離與結構鑒定［J］．中草藥，2006，27(4):195－199．