人工種植和野生三葉青中總黃酮含量的比較

吉慶勇，華金渭，程文亮，朱 波，王喜周，李美美

(1.浙江省麗水市農業科學研究院，浙江麗水 323000;2.麗水學院醫學院，浙江 麗水 323000;3.浙江省醫學科學院，浙江 杭州 323000)

三葉青(Tetrastigmatis hemsleyani Diels et Gilg)為葡萄科植物三葉崖爬藤地下塊莖，屬于我國特有植物，分布在浙江、江西、云南等省份。其性涼，味辛、無毒，常用于治療高熱驚厥，小兒感冒發燒、肝炎、支氣管炎及支氣管哮喘等癥，對一些病毒性疾病，慢性和遷延性疾病有很好的功效［1－2］。三葉青中的化學成份主要有黃酮、黃酮苷、淀粉、還原糖、甾類化合物、氨基酸等［3］，其中黃酮是重要的生理活性物質，具有很好的抗腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡等作用［4－5］。

隨著對三葉青藥用價值的深入研究，市場需求量必然進一步增加，而野生資源由于過度采挖，已瀕臨滅絕狀態。因此，既要保護數量極少的野生三葉青資源，又要滿足市場需要，促進其可持續發展，開展三葉青的人工種植十分必要。麗水市農科院近年來開展三葉青引種栽培和野生馴化，已人工種植20余畝。本文采用紫外可見分光光度法測定麗水地區不同區域野生和人工種植三葉青中的黃酮含量，并對結果進行了分析［6］，以期為今后大面積的三葉青人工種植提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-120-02型紫外-可見分光光度計(日本島津);BP-II-5分析天平(上海醫用激光儀器廠生產)，SHZ-C型水循環式多用真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠);202A-2電熱干燥箱(上海陽光試驗儀器有限公司)等。蘆丁標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號 100080-200306)，乙醇、NaNO2，Al(NO3)3，KOH均為分析純。

1.2 試驗材料

于2011年3月至4月，從麗水松陽縣、麗水蓮都區、麗水景寧縣、麗水青田縣、麗水農科院栽培基地實地采集三葉青樣品，全部為鮮品(編號為:S1-人工、S2-人工、S3-人工，均為農科院三葉青種植基地5年生樣品，野生樣品編號為S4-松陽、S5-景寧、S6-蓮都、S7-青田)。

1.3 方法

1.3.1 測定波長的選擇

取對照品和供試品分別置25 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以紫外可見分光光度法測定在200～700 nm區間掃描吸收曲線。供試品溶液在500 nm處有最大吸收，與蘆丁對照溶液吸收曲線相似，故選用500 nm為測定波長［7］。

1.3.2 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品2.80 mg置于50 mL，加70%乙醇溶解，定容至刻度，搖勻，得濃度為0.056 mg·mL－1的蘆丁對照品溶液。

1.3.3 標準曲線的繪制

精密吸取 0.3，0.5，0.7，0.9，1.1，1.3 mL蘆丁對照溶液，分布置于10 mL容量瓶中，方法同1.3.1，測定吸光值，得標準曲線為 C=9.137×10－2A －4.524 ×10－3，其線性范圍為 8.02 ～39.35 mg，r2=0.998 9。

1.3.4 供試品溶液的制備與含量測定

取本品粉碎，過60目(0.25 mm)篩，精密稱取0.50 g，置圓底燒瓶中，加乙醇50 mL，加熱回流提取2次，每次1 h，取出冷卻，過濾，濾液揮發干，殘渣用適量乙醇溶液轉移到10 mL容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻即得。精密量取0.5 mL，分別置10 mL量瓶中，按1.3.1中方法測定吸光度，試驗重復3次。

1.3.5 重現性試驗

精確稱取三葉青樣品3.0 g，處理后在500 nm處測定吸光度，重復5次，回歸方程法計算平均總黃酮的質量濃度，其RSD為1.67%。該試驗方法重現性較好。

1.3.6 穩定性試驗

精密稱取0.4 mL供試品溶液于10 mL刻度試管中，加5%亞硝酸鹽溶液1.0 mL，搖勻放置5～6 min;加1.5 mol·L－1氫氧化鈉溶液 5.0 mL，加70%乙醇至滿刻度，搖勻放置10 min;取2.0～3.0 mL顯色液于比色皿中在500 nm之間掃描測定吸光度，每隔0.5 h測定1次，共測定7次，樣品提取液3 h穩定性較好。

1.3.7 精密度試驗

精密稱取蘆丁標準溶液1 mL，同“標準曲線的繪制”操作，連續測量6次，測定吸光度值，RSD為2.12%。

1.3.8 加樣回收率試驗

精密吸取蘆丁對照溶液1.0，1.5，2.0 mL各3份，分別加入供試品溶液3 mL，處理后在500 nm處測定吸光度，計算總黃酮含量，得其平均回收率為99.76%，RSD為2.61%。

2 結果與分析

人工種植與野生三葉青總黃酮的含量比較見表1。人工種植三葉青總黃酮含量最高為S2基地，含量達 11.226 8 mg·g－1，平均為 10.194 3 mg·g－1。野生樣品平均總黃酮含量為10.160 1 mg·g－1，其中麗水松陽樣品含量最高，達到10.925 9 mg·g－1，麗水蓮都最低，僅為 9.162 5 mg·g－1。研究結果表明，人工種植三葉青總黃酮含量與野生三葉青無顯著差異(P＞0.05)。從黃酮含量看，人工種植三葉青可以替代野生三葉青，彌補三葉青野生資源的不足，為開發三葉青中藥產品提供優質原料。

表1 人工種植與野生三葉青中總黃酮的含量(n=3)

3 小結和討論

三葉青作為一種珍稀的中藥，化學成分復雜，其開發利用尚處起步階段，其中所含主要化學成分黃酮具有顯著的生物學活性，具有很好的抗菌、抗病毒、抗腫瘤的特點。對野生與人工種植產品總黃酮含量的分析、比較，科學評價人工種植三葉青的質量，對控制三葉青藥材質量，深入開展三葉青的種植馴化研究及資源利用有重要意義，為開發利用三葉青資源和確保人工種植的品質提供了科學的依據。

［1］楊學樓，羅經，孫松柏，等．三葉青抗病毒作用的研究［J］．湖北中醫雜志，1989(4):40.

［2］鐘曉明，毛慶秋，黃真，等．三葉青提取物對燙傷大鼠腸道局部和全身免疫功能的影響［J］．中藥材，2006，29(9):953.

［3］李瑛琦，陸文超，于治國，等．三葉青的化學成分研究［J］．中草藥，2003(11):34.

［4］丁剛強，鄭軍獻，魏克民，等．三葉青提取物對肝癌細胞HepG-2及原代大鼠肝細胞的體外毒性作用研究［J］．浙江預防醫學，2005，17(9):122.

［5］馮正權，倪克鋒，何煜，等．三葉青黃酮誘導 SGC-7901胃癌細胞凋亡的實驗研究［J］．中國臨床藥理學與治療學，2006，11(6):669.

［6］毛一亮，張佳佳，丁萍月，等．正交設計法優化三葉青中總黃酮的提取工藝［J］．西北藥學雜志，2008，12(28):369.

［7］蔣新龍．廣玉蘭葉、花總黃酮提取方法與含量比較［J］．浙江農業科學，2010(3):648－650，664.