銀杏內酯B對高膽固醇誘導的PC12細胞膽固醇含量的影響*

郭茂娟，范英昌，盧 斌，姜希娟△

(天津中醫藥大學1病理三級實驗室，2病理教研室，天津 300193)

越來越多的研究認為外周膽固醇升高會上調腦膽固醇水平，進而導致神經元結構受損、功能降低，誘發阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)，有研究甚至認為膽固醇代謝紊亂是AD病理生理的核心［1］。因此，調節神經元膽固醇代謝是防治AD的新思路。PC12細胞是一種常用的神經細胞株，來源于大鼠腎上腺髓質分泌兒茶酚胺的嗜鉻細胞瘤(一種交感神經系統的腫瘤)，其胞質內含有大量嗜鉻顆粒，富含合成及分解多巴胺所需的酶，具有神經分泌細胞和神經元的性質，且增殖能力強。因此，PC12細胞被廣泛用于代替神經元進行研究［2－3］。

近年來銀杏葉提取物被廣泛用于防治AD，取得了較好療效，然而其作用機制尚未完全闡明。我們前期研究發現銀杏葉所含單體銀杏內酯B(ginkgolide B，GB)可以有效降低離體培養神經元膽固醇含量，提示調節腦膽固醇可能是其防治AD的作用機制之一。然而，機體外周與中樞之間存在完整的血腦屏障(blood－brain barrier，BBB)，絕大多數物質無法自由通過。因此，離體單獨干預神經元的效果，很難在體重現。為了驗證BBB存在時GB能否同樣干預神經元膽固醇含量，本研究利用Transwell裝置，將星形膠質細胞(astrocyte，Ast)和腦微血管內皮細胞(brain microvascular endothelial cells，BMECs)共培養，模擬在體BBB環境，在此環境下觀察GB對高膽固醇條件下PC12細胞膽固醇含量的影響，揭示GB防治AD的潛在作用機制。

材料和方法

1 細胞

PC12細胞株(大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤，購于中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC)。

2 藥品及試劑

DMEM培養基(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，馬血清(Gibco)，多聚－L－賴氨酸(Sigma)，MTT試劑盒(購自北京中西泰安技術服務有限公司)，可溶性膽固醇(Sigma)，血管內皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和辛伐他汀均購自Sigma，GB標準品購自寶雞貝斯特植物原料有限公司。其余試劑均為市售分析純。

3 儀器

CO2培養箱(Sanyo)，超凈化工作臺(日立)，Leica倒置顯微鏡，酶標儀(Lab systems)，高效液相色譜儀(Varian Prostar 210)，高壓泵(Prostar 210)，反相色譜柱(ZORBAX Eclipse XDB －C184.6 ×250 mm，5 μm，Agilent)，紫外檢測器(Varian Prostar 325)，色譜數據處理系統(LC Work－station V6.2)。

4 方法

4.1 原代腦微血管內皮細胞的培養 選取2周齡的SD大鼠，脫臼處死，消毒后分離出大腦皮質，DMEM培養液漂洗后，將其剪碎、勻漿，再加入0.1%Ⅱ型膠原酶37℃水浴消化30 min，離心、棄上清。加入20%牛血清白蛋白懸浮混勻后離心，加入2 mL 0.1%膠原酶/分散酶懸浮混勻后37℃水浴消化30 min，離心、棄上清，再次加入20%BSA懸浮混勻后離心，即可獲得底部黃白色的“微血管層”。吸取出底部“微血管層”，加入DMEM離心2次，棄上清，加入腦微血管內皮細胞培養液(DMEM高糖，20%胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，1 g/L肝素，1 μg/L堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，10 μg/L 血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，懸浮后接種于涂有明膠的塑料培養瓶中，第2代用于本實驗。

4.2 原代星形膠質細胞的培養與純化 新生2～3 d Wistar大鼠，脫臼處死，消毒后，取腦，解剖顯微鏡下剝除腦膜，取兩側大腦皮質，D－Hanks液洗2次，剪碎后，0.125%胰酶液37℃消化10 min，終止消化，輕輕吹打，濾網過濾后，1000 r/min離心5 min，加入含20%胎牛血清的DMEM培養基混懸沉淀，接種入培養瓶中，CO2培養箱中培養60 min后取出，輕輕翻轉培養瓶，吸取上清液種植于另一預先涂有L－多聚賴氨酸的培養瓶中，放入培養箱中繼續培養。培養7～10 d待細胞分層生長后，置于37℃搖床中250 r/min振蕩24 h，棄上清液，D－Hanks液洗3次，加入0.25%胰酶消化，終止消化后，細胞懸液1000 r/min離心5 min，棄上清，加入含20%胎牛血清的DMEM培養基混懸沉淀，接種入預先涂有L－多聚賴氨酸的培養瓶中繼續培養，第2代用于本實驗。

4.3 PC12培養方法 PC12細胞株培養于含10%胎牛血清、10%滅活馬血清和1%雙抗(鏈霉素和青霉素)的DMEM培養基中。在5%CO2、37℃的培養箱內培養，2～3 d更換培養液1次，細胞融合度達70% ～80%時，用彎頭吸管適力吹打至細胞大部分脫落，800 r/min離心5 min，棄上清，完全培養基重懸，1∶3傳代，實驗均取對數生長期細胞。

4.4 PC12細胞膽固醇損傷模型建立 收集對數生長期細胞，用完全培養基重懸計數，以5×105/cm2的密度種于事先用L－多聚賴氨酸包被的6孔板中。待細胞密度達到70%～80%時，將培養有內皮細胞和星形膠質細胞的Transwell(孔徑0.45 μm)建成體外BBB模型，并置于培養有PC12細胞的6孔板內。在Transwell內皮細胞側加入含40 μmol/L終濃度可溶性膽固醇的培養基繼續作用24 h，作為高膽固醇損傷細胞模型(3種細胞的種植方式見圖1)。

Figure 1.Transwell device for BBB model.BMECs:brain microvascular endothelial cells;Ast:astrocytes;PC12:PC12 cells.圖1 Transwell裝置示體外BBB模型示意圖

4.5 實驗分組及干預 對照組(N)，普通培養基培養;模型組(M)，40 μmol/L膽固醇處理24 h，更換正常培養基繼續培養16 h;西藥對照組(S)，40 μmol/L膽固醇處理24 h，更換含5 μmol/L辛伐他汀的培養基繼續培養16 h;銀杏內酯B中劑量組(GB－M)40 μmol/L膽固醇處理24 h，更換含MTT測量的最佳劑量GB的培養基繼續培養16 h;銀杏內酯B高劑量組(GB－H)，GB用量為5倍于中劑量組，其余同GB－M組;銀杏內酯B低劑量組(GB－L)，GB用量為中劑量組的1/5，其余同GB－M組。(注:膽固醇加在Transwell內皮細胞側，模擬機體外周膽固醇作用于BBB模型后，進而作用于PC12細胞。)

4.6 MTT比色法確定藥物劑量 將 PC12細胞以1×105/cm2密度種植于96孔板，待細胞密度達到70% ～80%時，加入含40 μmol/L膽固醇的完全培養基作用24 h，然后，更換含有梯度濃度銀杏內酯B的完全培養基作用16 h。棄上清，無色D－Hanks清洗2～3遍，置換無血清、無酚紅的含0.5 g/L MTT的無色培養基，每孔100 μL，培養箱中作用4 h，棄上清，每孔加入100 μL DMSO作用10 min，充分振蕩后570 nm比色。

4.7 采用高效液相色譜法(high－performance liquid chromatography，HPLC)檢測神經元膽固醇含量

4.7.1 細胞內液收集 待細胞處理結束后，棄去培養基，PBS洗3遍。吹打后收集細胞，將每孔收獲好的細胞用220 μL裂解液裂解，3000 r/min離心5 min，取上清液用于細胞內膽固醇測定。另將收獲的細胞用220 μL裂解液裂解，3000 r/min離心5 min，為樣品，用BCA法測定蛋白含量。上清液中加入等體積的新鮮配制的15%KOH醇溶液，室溫渦旋至細胞溶解產物清亮，加入6%的三氯乙酸去蛋白。再加入等體積的正己烷∶異丙醇4∶1溶液(V/V)，將混合物渦旋5 min，然后1500 r/min離心5 min。收集上層有機相。將下層水相按上述方法重復抽提2次。將混合的有機相在真空冷凍干燥機中65℃干燥，在室溫冷卻后，加入100 μL異丙醇∶正庚烷∶乙腈35∶12∶52(V/V)，將樣本溶解，活性碳去色素，超聲除氣5 min，1500 r/min 離心 5 min，收集上清液，取 10 μL進樣，進行高效液相色譜分析。

4.7.2 標準曲線的繪制 精密量取 200、100、20、10、5 mg/L的膽固醇標準溶液各200 μL，加入50 μL 100 mg/L的豆甾醇內標液(標準溶液和內標溶液都用乙醇配制)，混勻，加0.3 mL水、0.5 mL乙醇、1 mL正己烷，混勻 15 min;取有機相500 μL，50℃揮發干燥，加入0.4 mL丙酮－硫酸－三氧化鉻溶液，反應衍生5 min，加入0.5 mL正己烷終止反應，加0.5 mL 水，混勻15 min，取300 μL 揮發干燥，加300 μL 流動相溶解，進樣 10 μL。

4.7.3 總膽固醇的測定 取10 μL進行蛋白定量，定量后，樣本再進行高效液相色譜分析。使用安捷倫HP1100高效液相色譜儀，采用Hypersil1 C18柱，以異丙醇∶乙睛=20∶80為流動相進行非梯度洗脫，流速1 mL/min，柱溫20℃，DAD檢測波長250 nm。按步驟繪制標準曲線，以膽固醇峰和內標峰面積之比與膽固醇濃度進行線性回歸，以回歸方程計算所測樣品總膽固醇濃度。

5 統計學處理

采用SPSS 16.0軟件包先進行數據正態性檢驗，數據以均數±標準差()表示，運用單因素方差分析統計法。方差齊性檢驗P＜0.05，表明方差不齊，進行兩兩比較時選用Tamhane's T2檢驗，如果方差齊性檢驗P＞0.05，則選用LSD檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 形態學觀察

倒置相差顯微鏡下觀察發現PC12細胞接種6 h后可見細胞呈單層聚集生長，大多細胞呈圓形、短梭形或三角形，胞漿伸展，細胞兩極有短突起，細胞折光性好，胞核可見。隨時間的延長，72 h細胞成堆聚集生長明顯，細胞間沒有空隙，貼壁較松，隨密度的增大可見重疊生長及懸浮生長，見圖2。

Figure 2.Cultured PC12 cells under microscope(×100).圖2 體外培養的PC12細胞

2 MTT比色實驗選擇GB的給藥濃度

參照文獻用藥資料設定大致濃度范圍后，采用MTT法檢測細胞活力，選定最佳A值作為中劑量組濃度，采用其1/5劑量作為低劑量組濃度，采用其5倍劑量作為高劑量組濃度。GB濃度為5 μmol/L時A值最高，見表1，故本實驗選定GB的干預劑量為:低劑量 1 μmol/L，中劑量 5 μmol/L，高劑量25 μmol/L。

表1 梯度濃度GB對PC12細胞活力的影響Table 1.The effect of different concentrations of GB on PC12 cell viability(.n=8)

表1 梯度濃度GB對PC12細胞活力的影響Table 1.The effect of different concentrations of GB on PC12 cell viability(.n=8)

*P ＜0.05 vs GB 0 μmol/L group.

0.308 ±0.0701.25 0.329 ±0.0602.5 0.346 ±0.05050.422 ±0.09010 0.422 ±0.030*20 0.420 ±0.040*40 0.418 ±0.05080 0.417 ±0.0300*

3 高效液相色譜法檢測PC12細胞膽固醇的含量

采用高效液相色譜法檢測不同干預條件下PC12細胞內膽固醇含量，結果顯示培養基內加入40 μmol/L可溶性膽固醇后，PC12細胞內膽固醇含量升高，與對照組相比差異顯著(P ＜0.01)。將不同濃度銀杏內酯 B(1 μmol/L、5 μmol/L 和25 μmol/L)加入上述模型中，處理16 h后發現25 μmol/L GB降膽固醇的效果最佳，與模型組相比差異顯著(P＜0.05)，與陽性對照藥辛伐他汀組比較沒有顯著差異(P＞0.05)，見表2。

表2 高膽固醇環境下PC12細胞膽固醇變化及GB的影響Table 2.The effects of GB and simvastatin on intracellular cholesterol content in PC12 cells exposed to high cholesterol()

表2 高膽固醇環境下PC12細胞膽固醇變化及GB的影響Table 2.The effects of GB and simvastatin on intracellular cholesterol content in PC12 cells exposed to high cholesterol()

*P ＜0.05 vs control;＊＊P ＜0.01 vs high cholesterol.

Group n Cholesterol(g/g protein)Control 8 2.29 ±0.26＊＊High cholesterol 8 3.67 ±0.43 High cholesterol+simvastatin 8 2.96 ±0.40*High cholesterol+GB 1 μmol/L 8 3.49 ±0.67 High cholesterol+GB 5 μmol/L 8 3.37 ±0.89 High cholesterol+GB 25 μmol/L 7 3.00 ±0.53*

討 論

膽固醇參與合成激素、構成細胞生物膜，是人體不可或缺的重要成分。適量膽固醇是腦組織合成激素和神經遞質，維持腦細胞正常結構和功能的物質基礎。然而，腦膽固醇含量過高也會導致神經元結構受損，功能降低，導致AD等疾病發生［4－6］。膽固醇代謝與AD發病機制的深入研究為治療和預防AD藥物的開發提供了一個新的方向。

從細胞和分子水平系統、深入研究AD需要建立良好的AD體外模型。以往的研究常采用單獨原代培養的神經元建立模型，該模型雖具代表性和特異性，但因培養系統不穩定，實驗周期長而使其應用受到一定限制。PC12細胞因具有神經元的特性，且增殖能力強，細胞特性穩定，而被廣泛用于代替神經元進行研究。另外，單獨培養的神經元無法體現外周與中樞存在血腦屏障的生理環境。利用Transwell裝置將腦血管內皮細胞和星形膠質細胞共培養則解決了體外血腦屏障的問題。本研究中發現BBB模型建立后，跨膜細胞電阻(TEER)可以達到312～340 Ω/cm2時(本文未顯示)，提示模型建立成功，符合體外BBB標準。

我們前期實驗顯示GB能夠有效降低高膽固醇環境下PC12細胞的膽固醇含量，但是基于BBB背景下，外周高膽固醇作用于該模型后，GB對PC12細胞是否還具有保護作用?因此，本實驗在前期實驗基礎上，利用40 μmol/L終濃度的可溶性膽固醇作用于BBB，成功復制PC12高膽固醇損傷模型，比較接近在體的內環境，且實驗條件易于控制，是體外進行AD 研究的理想模型［3，7－8］。

在銀杏內酯中，銀杏內酯B的生理活性最強，是迄今發現的最強的血小板活化因子拮抗劑，同時對損傷神經元具有保護作用［9］。德國產的銀杏葉提取物——金納多已經用于臨床治療多種疾病，對神經元保護作用目前頗受重視［10－11］，且臨床證實對AD患者有一定療效，故該實驗采用銀杏內酯B作為干預藥物。陽性對照藥物選擇辛伐他汀，作為羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶競爭性抑制劑，抑制羥甲基戊二酸單酰輔酶A形成，限制膽固醇合成。

本實驗主要采用高效液相色譜法檢測了不同干預條件下PC12細胞內膽固醇含量，結果顯示培養基內加入高濃度可溶性膽固醇后，細胞內膽固醇含量升高，提示膽固醇升高可以影響腦膽固醇含量。梯度濃度的銀杏內酯B干預上述模型后，可以不同程度地影響神經元膽固醇含量，其中以高劑量組效果最佳，顯示了一定程度的劑量依賴性。提示調節腦膽固醇含量可能是銀杏內酯B防治AD的機制之一，為其防治AD提供了實驗依據。

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