大腸埃希氏菌在葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎恢復中的作用*

李旺林，曹 杰，肖煥擎，張偉健，楊 平，鐘俊斌，張 通

(廣州醫學院附屬廣州市第一人民醫院胃腸外科，廣東 廣州 510180)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一類腸道慢性、反復發作性非特異性炎癥性疾病，包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease，CD)。IBD在我國的發病率逐年升高。腸道菌群是結腸炎癥發病的必要條件［1］，但關于腸道正常菌群在結腸炎癥恢復中的作用并未得到充分重視，目前國內外尚未見相關報道。本課題擬對此進行探索，以明確腸道大腸埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)在結腸炎癥恢復中的作用。

材料和方法

1 試劑

葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)分子量5 kD，購自Sigma，用生理鹽水配制成3.5%濃度［2］。抗生素混合物:卡那霉素(8 g/L)、慶大霉素(0.7 g/L)、多黏菌素(3.4 ×107U/L)、甲硝唑(4.3 g/L)和萬古霉素(0.9 g/L)加入飲用水中。

2 動物

2.1 細菌耗竭小鼠(bacteria－depleted mice，BD小鼠)的制作 6周大成年小鼠，通過添加混合抗生素(每天每只鼠用100 μL混合抗生素)來耗盡腸腔內細菌，加入飲用水2周，制作BD小鼠。使用抗生素后，收集小鼠新鮮糞便樣本，每天在3種不同培養基、有氧和無氧條件下進行細菌檢測。培養基中不能檢測出細菌為BD小鼠制作成功。

2.2 動物及分組 BALB/c小鼠，SPF級，雌性，8周齡，體重(19.2 ±2.0)g，分籠飼養，平均每籠6 只。溫度20～22 ℃，相對濕度55%±5%。建立12 h明暗周期。隨機分成4組:(1)生理鹽水組，不用DSS水喂養，一直飲用正常飲用水;(2)單純DSS組，正常BALB/c小鼠DSS 5 d造模+正常飲用水14 d;(3)BD小鼠+DSS組(無E.coli處理組)，BD小鼠5 d造模+正常飲用水14 d;(4)BD小鼠+DSS+E.coli組(E.coli處理組)，BD小鼠DSS 5 d造模+正常飲用水(同時以E.coli喂養，每次1×109CFU，每2 d喂養1次)14 d。

2.3 動物處理 前5 d自由飲用3.5%DSS溶液造成潰瘍性結腸炎模型［2］，然后繼續正常飲水14 d。前3組均予以正常飲食飲水;BD小鼠E.coli處理組予以E.coli喂養，1×109CFU/次，每2 d喂養1次。每天測量動物體重，記錄大便性狀和隱血情況，計算疾病活動度(disease activity index，DAI)評分，具體評分標準見表1。同時記錄小鼠的死亡情況。第14 d，二氧化碳法處死小鼠，游離結腸和遠端回腸，取出肛門至盲腸末端的整個結腸和直腸段，觀察各組小鼠結腸的大體改變，測量整個結腸長度。用預冷無菌生理鹽水將結腸沖洗干凈，分別于結腸末端(距肛門1 cm)處剪取0.5 cm長的結腸，4%甲醛浸泡，石蠟包埋、切片，HE染色做病理檢查。

表1 DAI評分標準Table 1.DAI scoring standard

3 按前述解剖方法獲取的組織學標本HE染色

標本固定、石蠟包埋、切片及HE染色后，由病理科醫生采用盲法對病理切片進行評分。結腸炎的組織學嚴重程度依照Cooper等［3］提出的評分標準分為黏膜損害(D)和病變范圍(E)兩方面。具體評分標準:黏膜損害(D):0分:無;1分:靠近基膜1/3的隱窩丟失;2分:靠近基膜2/3的隱窩丟失;3分:隱窩全部消失，上皮細胞完整覆蓋;4分:隱窩、上皮均消失;病變范圍(E):0分:無;1分:局灶性;2分:病變約累及1/3黏膜;3分:病變約累及2/3黏膜;4分:病變累及全部黏膜組織。組織病理學評分的總分(histological score，HS)等于D與E的乘積，即HS=D×E。

4 結腸組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的檢測

依Krawisz等［4］方法測定組織MPO活性，作為評價中性粒細胞浸潤的指標之一。取50～100 mg病變結腸組織，準確稱量后迅速至液氮中冷卻，－80℃保存。測定時將組織切碎制成勻漿，離心后取上清液于460 nm處測吸光度(A)值，5 min后再次測定，獲得該樣本的MPO活性，以U/g組織表示。

5 免疫組織化學方法檢測核轉錄因子－κB(nuclear factor kappa B，NF －κB)活化

應用標準的三步法(標記的鏈酶親和素－生物素法，即LSAB法)進行檢測。Ⅰ抗為NF－κB p65亞基［5］的特異性單克隆抗體:Ⅱ抗為生物素標記山羊抗鼠IgG抗體，兩者均為Santa Cruz產品。取400倍視野5個進行評分，取其平均。根據NF－κB陽性細胞百分比進行評分，評分標準參照文獻［6］:0分:0% ～1%;1分:2% ～5%;2分:6% ～10%;3分:11% ～25%。

6 統計學處理

采用GraphPad Prism軟件進行數據處理，數據用均數±標準差()表示。組織學評分采用非參數檢驗，其余數據使用單因素方差分析，以P＜0.05為有統計學意義。

結 果

1 體重變化

各組飲用DSS的小鼠體重均有下降，而且在停止飲用DSS后正常BALB/c小鼠體重繼續稍有降低，無E.coli處理的BD小鼠組體重繼續出現下降，E.coli處理組體重亦稍有下降。至實驗第18 d，后兩組體重比較有顯著差異(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.Weight changes of the mice in different groups..n=10，*P ＜0.05 vs BD+DSS+E.coli group.圖1 各組體重變化

Figure 2.The change of survival rate in each group after DSS treatment.n=10.圖2 DSS處理后各組生存率的變化

2 各組的死亡率

觀察至實驗結束，生理鹽水組、DSS組和E.coli處理組的存活率均為100%;無E.coli處理組的死亡率為40%。這說明，BD小鼠經DSS處理增加了死亡率。而對DSS處理的BD小鼠隨后的E.coli喂養減少了其死亡率，見圖2。

3 小鼠的DAI評分

飲用DSS的小鼠從第3 d開始出現大便隱血陽性，DAI評分均見不同程度的增加，停止飲用DSS后DAI評分繼續緩慢增高，各組在實驗第10 d DAI評分出現一次高峰，而后DSS組和E.coli處理組評分緩慢下降;至實驗結束時DSS組DAI評分低至5.3±1.7;E.coli處理組 DAI評分與無 E.coli處理組有顯著差別(P＜0.05)，見表2。

表2 各組小鼠DAI評分Table 2.DAI scores of the mice in different groups(.n=6)

表2 各組小鼠DAI評分Table 2.DAI scores of the mice in different groups(.n=6)

△P ＜0.05 vs DSS;*P ＜0.05 vs BD+DSS.

Group 3 d 6 d 10 d 18 d Normal saline 0 0 0 0 DSS 2.6±1.0 7.6±2.1 7.0±1.8 5.3±1.7 BD+DSS 2.2±0.7 7.4±1.6 8.7±0.4△ 9.8±0.4△BD+DSS+E.coli 2.3±0.4 7.5±0.5 7.0±0.6* 6.4±0.3*

4 小鼠結腸重量與長度變化

飲用DSS的小鼠結腸長度較正常小鼠縮短，其中單純DSS組小鼠和E.coli處理組結腸長度稍長于無E.coli處理的BD小鼠組(P＜0.05);將結腸清洗后測量全結腸重量，與無E.coli處理組比較，E.coli處理組重量減輕，兩者差異顯著(P＜0.05)，見表3。

表3 不同處理組的結腸長度、結腸重量、組織病理評分、MPO活性和NF－κB評分Table 3.Colon length，colon weight，histological score(HS)，MPO activity and NF－κB score in different groups(.n=8)

表3 不同處理組的結腸長度、結腸重量、組織病理評分、MPO活性和NF－κB評分Table 3.Colon length，colon weight，histological score(HS)，MPO activity and NF－κB score in different groups(.n=8)

△P ＜0.05 vs DSS;*P ＜0.05 vs BD+DSS.

Group Colon length(cm)Colon weight(mg) HS MPO(U/g) NF－κB Normal saline 8.8 ±0.6 323.3 ±23.2 0.0 ±0.0 0.2±0.1 0.3 ±0.5 DSS 6.9 ±0.9 450.3 ±25.6 6.3 ±2.4 0.9 ±0.2 2.3 ±0.5 BD+DSS 6.2 ±0.6△ 638.7 ±20.6△ 9.2 ±2.3△ 0.4 ±0.2△ 1.0 ±0.0△BD+DSS+E.coli 6.8 ±0.9* 474.7 ±19.1* 6.8 ±2.1* 0.9 ±0.1* 2.3 ±0.6*

5 小鼠結腸病理組織學

無E.coli處理的BD小鼠在恢復期結腸組織學見炎癥累及黏膜基底層，表現為廣泛的黏膜、腺體缺損，隱窩破壞和大量的炎癥細胞浸潤。E.coli處理后，小鼠結腸黏膜缺損部分修復，隱窩破壞減少，炎性細胞浸潤減輕，炎癥深度約為粘膜全層1/3～2/3;單純DSS組組織損傷稍輕。與無E.coli處理組比較，E.coli處理組組織損傷減輕，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖 3、表 3。

6 MPO活性

E.coli組腸黏膜MPO活性與無E.coli處理組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

7 活化的NF－κB免疫組織化學染色及半定量分析

DSS組和E.coli處理組可見較多NF－κB活化的細胞，即陽性細胞。活化的NF－κB主要見于固有層中，高倍鏡下可見染色主要位于細胞核，呈棕褐色。相比之下，無E.coli處理組陽性細胞明顯減少。無E.coli處理組活化的NF－κB評分明顯低于DSS組和E.coli處理組，見圖4、表3。

討 論

IBD被認為起因于腸道菌群的免疫反應失調，但腸道菌群影響IBD的發展機制目前仍不清楚［7］。腸腔內每克糞便中包含多達1×1011個細菌。腸道微生物與之間的相互溝通和黏膜已被證明可以調節腸道基因的表達。細菌菌落已被證明在IBD發展中起著重要作用。在這種疾病的各種小鼠模型中，在無菌條件下不能產生腸道炎癥，而在無菌性小鼠中重新植入小鼠的正常腸道菌群，則可以導致腸道炎癥的發生［8］。腸黏膜中非致病性微生物可以改變免疫反應在體外腸上皮屏障功能。E.coli是人和許多動物腸道中最主要且數量最多的一種細菌［9］，周身鞭毛，能運動，無芽孢，主要生活在大腸內，為大腸內的正常菌群。腸道正常E.coli是否參與了實驗性結腸炎的恢復，目前尚未見相關報道。

Figure 3.HE staining of the mouse colon sections(×40).A:normal saline;B:DSS;C:BD+DSS;D:BD+DSS+E.coli.圖3 小鼠結腸HE染色

Figure 4.NF － κB detection of the mouse colon sections(×200).A:normal saline;B:DSS;C:BD+DSS;D:BD+DSS+E.coli.圖4 小鼠結腸NF－κB檢測

通常來說，DSS誘導所造成的小鼠結腸炎能夠自愈［10］。相反，BD小鼠口服抗生素2周，不能夠從DSS誘導引起的損傷中恢復，表明宿主腸道微生物的相互作用是恢復的必需的條件。實驗結果證明，共生的 E.coli能夠降低BD小鼠中DSS誘導小鼠的死亡率，促進結腸炎癥恢復。外源性E.coli的喂養能夠促進結腸炎癥恢復，降低DSS誘導炎癥小鼠死亡率，強烈提示了腸道E.coli在DSS誘導結腸炎癥中的恢復作用，提示正常腸道E.coli的存在是結腸炎癥恢復的必要條件，正常腸道E.coli可能能夠治療結腸炎癥，在結腸炎癥中調整腸道菌群有助于腸道炎癥恢復。

由于腸黏膜炎癥壞死潰瘍形成導致結腸縮短，這些改變客觀地反映了腸組織的損傷程度。飲用DSS小鼠結腸長度均較正常小鼠縮短，但喂養結腸正常腸道E.coli可以阻止結腸縮短，這可能與E.coli能夠減少腸道炎癥，減少疤痕形成有關。病理組織學方面，各組小鼠結腸大體較呈現腸腔內少量積血，鏡下見隱窩和腺體有不同程度的破壞，但炎性細胞浸潤較為明顯。E.coli治療組可以恢復腸黏膜完整性，減少腸道出血和炎癥細胞的浸潤，動物組織學評分比較常規組均有降低。結果說明E.coli對DSS誘導的結腸炎癥有促進恢復的作用。

給BD小鼠喂養大腸陰性桿菌能夠提高DSS所致NF－κB的活化指標，與無E.coli喂養組比較，差異有統計學意義。因此，上述研究結果提示，正常大腸陰性桿菌可以促進NF－κB活化，促進炎性細胞趨化，加速炎癥恢復。腸道中無正常菌群的小鼠NF－κB的活化指標較低，而且不能從DSS誘導的結腸炎癥中自行恢復。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)來源于腸道菌群，是革蘭陰性細菌細胞壁的主要成分之一，可通過破壞的上皮屏障進入循環并激活NF－κB［11］，如前所述，NF－κB是調控一系列炎癥因子表達的轉錄因子。由于腸道中無正常菌群，所以腸道中缺少LPS，而LPS缺乏導致了腸道內NF－κB不能或者較少激活，從而不能啟動腸道的抗炎保護機制，使之難以從DSS誘導腸炎中自行恢復。在我們給小鼠喂養E.coli后，增加了腸道內LPS含量，從而使NF－κB能夠正常激活，這一條抗炎途徑能夠啟動，使小鼠能夠在DSS誘導的結腸炎中逐漸得到恢復。提醒我們，腸道正常菌群的存在可能是腸炎恢復的必要條件。

［1］歐陽欽，王玉芳，胡仁偉.等.中國炎癥性腸病患病情況分析［J］.中華消化雜志，2008，28(12):814 －818.

［2］Chen J，Xie L，Toyama S，et al.The effects of Foxp3 －expressing regulatory T cells expanded with CD28 superagonist antibody in DSS － induced mice colitis［J］.Int Immunopharmacol，2011，11(5):610 －617.

［3］Cooper HS，Murthy SNS，Shah RS，et al.Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis［J］.Lab Invest，1993，69(2):238 －249.

［4］Krawisz JE，Sharon P，Stenson WF.Quantitative assay for acute intestinal inflammation based on myeloperoxidase activity.Assessment of inflammation in rat and hamster models［J］.Gastroenterology，1984，87(6):1344 －1350.

［5］Kaltschmidt C，Kaltschmidt B，Henkel T，et al.Selective recognition of the activated form of transcription factor NF－ κB by a monoclonal antibody［J］.Biol Chem Hoppe Seyler，1995，376(1):9 －16.

［6］Bantel H，Berg C，Vieth M，et al.Mesalazine inhibits activation of transcription factor NF－κB in inflamed mucosa of patients with ulcerative colitis［J］.Am J Gastroenterol，2000，95(12):3452 －3457.

［7］王 輝，黃美近，康 亮，等.蛋白酶激活受體在炎性腸病大鼠模型迷走神經背側運動核的表達及作用［J］.中國病理生理雜志，2009，25(5):998 －1003.

［8］Schuhz M，Vehkamp C，Dielemen LA，et al.Laetobacillus plantarum 299V in the treatment and prevention of spontaneous colitis in interleukin－10－deficient mice［J］.Inflamm Bowel Dis，2002，8(2):71 －80.

［9］Amar J，Chabo C，Waget A，et al.Intestinal mucosal adherence and translocation of commensal bacteria at the early onset of type 2 diabetes:molecular mechanisms and probiotic treatment［J］.EMBO Mol Med，2011，3(9):559－572.

［10］Zhang R，Ito S，Nishio N，et al.Dextran sulphate sodium increases splenic Gr1+CD11b+cells which accelerate recovery from colitis following intravenous transplantation［J］.Clin Exp Immunol，2011，164(3):417 －427.

［11］French N，Pettersson S.Microbe－host interactions in the alimentary tract:the gateway to understanding inflammatory bowel disease［J］.Gut，2000，47(2):162－163.