STAT3和SOCS3與子宮內膜異位癥的相關性研究*

涂飛霞，阮 菲， 吳瑞瑾，詹 宏， 馬俊彥，林 俊

(浙江大學醫學院附屬婦產科醫院婦產科，浙江 杭州 310006)

子宮內膜異位癥(內異癥)是一種常見的良性婦科疾病，多見于育齡期婦女，其引起的痛經、盆腔疼痛、不孕等問題嚴重影響婦女的生活質量和生育能力［1］。內異癥雖然是一個良性疾病，但具有類似腫瘤的惡性生物學行為如增殖、侵襲及復發等［2－3］。Janus激酶/信號轉導與轉錄活化因子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信號通路與細胞分化、增殖、侵襲和凋亡密切相關，并受細胞因子信號抑制因子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)的負反饋調節。STAT3和 SOCS3是 STAT家族和SOCS家族的重要成員，研究發現在多種腫瘤中存在著STAT3的過度活化和SOCS3表達的減少或缺失［4］。內異癥異位病灶的形成與腫瘤轉移非常相似，需要異位子宮內膜細胞的黏附增殖、細胞外基質的降解、新生血管生成以及抵抗機體免疫清除等過程。目前STAT3和SOCS3在內異癥中的表達尚未見報道，我們分別檢測了內異癥患者異位、在位子宮內膜組織和非內異癥患者子宮內膜組織中STAT3、磷酸化STAT3和SOCS3在蛋白水平的表達情況，以揭示STAT3和SOCS3與內異癥的相關性。

材料和方法

1 材料

1.1 標本 85例組織標本收集自2011年3～4月在浙江大學醫學院附屬婦產科醫院行手術治療的患者。30例異位子宮內膜組織(異位組，n=30)取自行卵巢子宮內膜異位囊腫剝除術患者，并經病理確診為卵巢子宮內膜異位癥，年齡(37.7±6.7)歲，根據r－AFS分期，Ⅰ/Ⅱ期有2例，Ⅲ/Ⅳ期28例。30例在位內膜組織(卵巢子宮內膜異位癥患者的子宮內膜，在位組，n=30)取自內異癥患者行子宮切除或刮宮術者，年齡(41.5±6.7)歲，疾病分期處于Ⅰ/Ⅱ期有4例，Ⅲ/Ⅳ期26例。25例對照子宮內膜組織(對照組，n=25)取自因縱隔子宮、子宮肌瘤、伴有輸卵管疾病的不孕癥行腹腔鏡檢查及手術的患者，并經腹腔鏡觀察未患子宮內膜異位癥，年齡(40.8±6.5)歲。3組患者年齡比較差異無統計學意義(P＞0.05)，在位和對照子宮內膜處于增殖期或分泌期依照病理檢查結果分期，異位內膜所處月經周期根據患者末次月經時間以及血清雌孕激素水平判斷。所有入選者均無內外科伴發疾病，有規律月經周期(28～32 d)，手術前3個月內未接受激素及其它藥物治療、未放置宮內節育器。實驗經本院倫理委員會審批通過，標本收集前均簽署本人知情同意書。組織標本經冰PBS清洗后立即放入液氮中，于－80℃冰箱中保存備用。

1.2 主要試劑 組織蛋白裂解液(成分:20 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，1%Triton X －100，sodium pyrophosphate，β － glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin，1 mmol/L PMSF)(碧云天)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京鼎國)，0.45 μm聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)(Pall Life Sciences)，ECL發光液(Biological Industries)，兔多克隆抗人SOCS3抗體、兔多克隆抗人STAT3抗體、兔多克隆抗人p－STAT3抗體(Tyr705)(Cell Signaling Technology)，鼠單克隆抗GAPDH抗體(Santa Cruz Technology)，辣根過氧化物酶標記的抗兔、抗鼠Ⅱ抗(Cell Signaling Technology)。

2 方法

Western blotting檢測STAT3、p－STAT3和SOCS3蛋白表達。取50 mg組織勻漿裂解提取蛋白質，BCA試劑盒測定蛋白濃度。取100 μg總蛋白在10%聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離后轉至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入兔抗 SOCS3、p－STAT3、STAT3和鼠抗 GAPDHⅠ抗(分別稀釋 1∶1000、1∶1000、1∶2000、1∶2000)4 ℃孵育過夜，室溫孵育相應的抗兔、抗鼠Ⅱ抗(分別稀釋1∶4000，1∶5000)1 h，應用ECL發光液，在ImageQuant LAS 4000 mini下曝光顯影。用ImageQuantTL 7.0軟件分析條帶灰度值，以GAPDH為內參照，比較3組SOCS3、STAT3分別與GADPH的灰度值比值，以及p－STAT3與STAT3灰度值比值評價STAT3活化程度。

3 統計學處理

結 果

1 STAT3及其活化形式p－STAT3在3組內膜組織中的表達

單因素方差分析顯示總STAT3蛋白的表達在3組中無顯著差異(P＞0.05)，而其活化形式Tyr705位點磷酸化的STAT3與總STAT3比值(p－STAT3/STAT3，即STAT3活化水平)呈現明顯差異(P＜0.01)。兩兩比較顯示異位組p－STAT3/STAT3與對照組(P＜0.01)和在位組(P＜0.01)的差異均有統計學意義，而在位組與對照組之間差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1、圖1。對照組中分泌期STAT3磷酸化水平高于增殖期(t=－3.864，P＜0.01)，而在位組(t=－0.681，P＞0.05)和異位組(t= －0.024，P＞0.05)中則不隨月經周期變化，見圖2。各組年齡在35歲及以上與年齡35歲以下者比較，p－STAT3/STAT3和總STAT3表達差異均無統計學意義(P＞0.05)。異位組中痛經患者與無痛經患者p－STAT3/STAT3表達無顯著差異(P＞0.05)。

2 SOCS3蛋白在3組子宮內膜組織中的表達

SOCS3蛋白在對照組中表達最高，在位組其次，異位組最低，見表1、圖1。3組間比較差異有統計學意義(P＜0.01)，異位組與對照組(P＜0.01)和在位組(P＜0.01)比較差異均有統計學意義，對照組與在位組比較無明顯差異(P＞0.05)。各組SOCS3蛋白的表達與月經周期無關(P＞0.05)，年齡大于等于35歲與小于35歲者SOCS3蛋白表達也無顯著差異(P＞0.05)。異位組中痛經患者與無痛經患者SOCS3表達比較無顯著差異(P＞0.05)。

Figure 1.The activation level of STAT3 and the expression of SOCS3 protein in the three groups..*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs the eutopic group.圖1 STAT3磷酸化活化水平與SOCS3蛋白表達

Figure 2.The activation level of STAT3 in the proliferative and secretory phases of different groups..*P＜0.05 vs the corresponding proliferative phase.圖2 STAT3磷酸化活化水平與月經周期的關系

3 STAT3磷酸化活化水平與SOCS3蛋白相關性分析

比較內異癥患者在位和異位內膜標本中SOCS3及STAT3磷酸化水平，發現SOCS3表達與p－STAT3/STAT3比值呈負相關(r=－0.499，P＜0.01)。

討 論

STAT3廣泛表達于各種組織和細胞，磷酸化活化后形成二聚體從細胞質進入細胞核，調控靶基因如細胞周期素D1(cyclin D1)、血管內皮生長因子(VEGF)、bcl－xL和 bcl－2等的表達，促進細胞生長、抵抗凋亡、血管生成及侵襲［5］。本研究結果顯示異位內膜中STAT3的磷酸化活化水平明顯高于在位和對照內膜，提示異位子宮內膜存在STAT3的過度活化。內異癥患者腹腔液中多種促炎性細胞因子如白細胞介素6(IL－6)、腫瘤壞死因子α(TNF－α)等分泌增多，而這些細胞因子是JAK/STAT3通路重要的激活因子，可能是引起異位子宮內膜細胞STAT3過度活化的原因之一。STAT3參與調節子宮內膜的蛻膜化，對受孕起重要作用，Dimitriadis等［6］發現p－STAT3在分泌期的子宮內膜腺上皮和間質細胞表達明顯高于增殖期。在對照子宮內膜，我們觀察到分泌期STAT3磷酸化水平明顯高于增殖期;而在內異癥患者的在位和異位內膜中，STAT3磷酸化水平不隨月經周期變化，提示內異癥患者STAT3的活化異常可能與在位和異位子宮內膜細胞蛻膜化分化能力異常［7］有一定的聯系，這些細胞因不能正常分化而表現出增殖能力增強，與異位病灶的形成和發展密切相關。

表1 各種蛋白在3組中的表達Table 1.Expression of different proteins in the three groups()

表1 各種蛋白在3組中的表達Table 1.Expression of different proteins in the three groups()

*P ＜0.05 vs the control group;△P＜0.05 vs the eutopic group;#P ＜0.05 vs the corresponding proliferative phase.

SOCS3(SOCS3/GAPDH)Total STAT3(STAT3/GAPDH)Activation of STAT3(p－STAT3/STAT3)Control(n=25)1.475 ±0.7890.749 ±0.408 0.541 ±0.243 0.919 ±0.601 Proliferative(n=14) 0.882 ±0.293 0.592 ±0.332 Secretory(n=11) 0.579 ±0.480 1.336 ±0.618#Eutopic(n=30) 0.623 ±0.220 0.678 ±0.271 0.979 ±0.416 Proliferative(n=19) 0.646 ±0.205 0.939 ±0.424 Secretory(n=11) 0.584 ±0.250 1.047 ±0.413 Ectopic(n=30) 0.263 ±0.156 ＊△ 0.684 ±0.317 1.471 ±0.738＊△Proliferative(n=18) 0.297 ±0.177 1.468 ±0.725 Secretory(n=12)0.211 ±0.103

SOCS3基因被描述為一種潛在的腫瘤抑制基因，它通過對JAK/STAT、局部黏著斑激酶(FAK)及促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)等途徑的負性調控而發揮抗腫瘤細胞生長、遷移等作用［4，8］。SOCS3基因啟動子含有 STAT3結合位點，受活化的STAT3誘導表達，并反饋抑制STAT3的活性。本研究發現在異位內膜中SOCS3蛋白表達明顯低于對照和在位內膜，異位內膜中過度活化的STAT3并沒有誘導SOCS3表達相應的上升，提示在內異癥中可能存在某些因素導致SOCS3蛋白下調，使其對多種信號的負反饋調節功能減弱，包括STAT3。在異位子宮內膜細胞，受促炎癥細胞因子激活的STAT3由于缺乏SOCS3的負反饋調節而處于持續過度活化狀態，進而引起細胞增殖和侵襲能力增強，故我們推測兩者的共同作用可能參與內異癥的發病。在正常子宮內膜細胞中，SOCS3對JAK/STAT等通路的負反饋處于平衡狀態，協調細胞的多種生物學行為。而在內異癥患者的在位子宮內膜，其SOCS3蛋白表達與對照內膜無差異，可能是內膜細胞逆流入腹腔后，在腹腔內環境的作用下出現多種信號通路活化異常、基因表達異常等，導致SOCS3蛋白表達下降，并進一步參與異位病灶的形成和發展。至于SOCS3表達異常的原因以及參與調控的信號機制都需要進一步深入探討。

本次研究首次證實在子宮內膜異位癥患者的異位子宮內膜組織中，存在STAT3的過度活化和SOCS3蛋白表達的下調，為我們探討內異癥發生發展的機制提供了新思路，下一步我們將從細胞分子水平研究STAT3活化及SOCS3下調的機制，為內異癥的治療及新藥研發提供一種新的策略。

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