慢性低氧高二氧化碳誘導(dǎo)肺動脈高壓小鼠肺組織白細胞介素6的表達*

唐巧玲，商 萍，朱美麗，金 露，王小同

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院康復(fù)、腦科中心，浙江 溫州 325000)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension， PAH)是以肺動脈壓力(pulmonary arterial pressure，PAP)進行性增高、肺血管阻力(pulmonary vascular resistance，PVR)進行性增加為特征的一組慢性進行性疾病，其病理過程、發(fā)病機制一直倍受關(guān)注。目前PAH發(fā)病機制尚未完全闡明，隨著研究的深入，炎癥機制在PAH發(fā)病中的作用日益受到重視。白細胞介素6(interleukin－6，IL－6)作為一種多效能的炎性細胞因子，可能在PAH發(fā)病機制中起重要作用。我們以慢性低氧(O2)高二氧化碳(CO2)誘導(dǎo)小鼠肺動脈高壓，初步探討IL－6在肺動脈高壓中的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 SPF級健康雄性小鼠16只，8周齡，體重22～24 g，由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。

1.2 主要儀器 常壓低氧高二氧化碳艙(溫州醫(yī)學(xué)院肺心病研究室研制)，Olympus顯微鏡，酶標儀，紫外分光光度儀，RT－PCR儀，梯度PCR儀等。

1.3 主要試劑 IL－6抗體(Abcam)，SP法免疫組化試劑盒(上海碧云天)，ELISA試劑盒(R﹠D)，Trizol reagen(Invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermantas)，引物(上海捷瑞)。

2 方法

2.1 動物分組及模型制備 實驗動物按隨機數(shù)字表法分成2組(n=8):慢性低O2高CO2組和正常對照組。低氧高CO2組置于常壓低氧高二氧化碳艙中，O2濃度為9% ～11%，CO2濃度為5% ～6%，每天8 h，每周6 d，持續(xù)4周，其余時間與對照組在同一室內(nèi)生活(室溫22～24℃，相對濕度 50% ～70%);對照組生活在正常大氣環(huán)境中，其它飼養(yǎng)條件與實驗組相同。

2.2 肺組織取材 飼養(yǎng)至規(guī)定時間后，2組小鼠用戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，打開胸腔，經(jīng)左心室溫生理鹽水灌注后，取左肺4%多聚甲醛固定，右肺液氮保存。

2.3 右心室肥大指數(shù) 取出心臟，解剖顯微鏡下沿心室間隔邊緣剪下右心室 (right ventricular，RV)及左室+室間隔 (left ventricle plus ventricular septum，LV+S)，用濾紙吸干后在電子天平上分別稱重。將右心室與左室加室間隔重量之比值RV/(LV+S)作為右心室肥大指數(shù)。

2.4 肺血管形態(tài)學(xué)指標檢測 肺組織石蠟切片4 μm行HE染色，光鏡下觀察肺血管的形態(tài)學(xué)變化;應(yīng)用Image－Pro Plus 6.0軟件圖像處理，對直徑在100 μm以內(nèi)的肺小動脈進行圖像分析，測量與呼吸性細支氣管及肺泡管伴行的肺小動脈外徑、管壁厚度、血管總面積及管壁面積，計算出管壁厚度占血管外徑的百分比(vessel wall diameter/total diameter，WT%)和管壁面積占血管總面積的百分比(vessel wall area/total area，WA%)，反映肺小動脈管壁增厚程度，每只小鼠2張不連續(xù)肺組織切片，每張切片隨機選取直徑50～150 μm的肺細小動脈2條，用圖像分析軟件(Image－Pro Plus 6.0)測量，取其平均值作為小鼠的肺血管形態(tài)計量學(xué)指標。

2.5 免疫組化觀測肺組織IL－6蛋白表達 肺組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化，高溫高壓抗原修復(fù)2 min，3%H2O2室溫孵育10 min消除內(nèi)源性過氧化氫酶，5%山羊血清封閉30 min，滴加IL－6Ⅰ抗(濃度1∶700)，4℃過夜，37℃復(fù)溫45 min，滴加辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，透明，封片。PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照。結(jié)果判讀:顯微鏡下肺動脈血管及管壁棕黃色為陽性表達。

2.6 ELISA檢測肺組織勻漿中IL－6濃度 參照Walley等［1］的方法制備肺組織勻漿，稱肺組織重量，加入冰PBS液研磨制備成10%(質(zhì)量分數(shù))組織勻漿，12000 r/min 4℃ 離心10 min，取上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟操作，在已用抗IL－6單抗包被的PVC反應(yīng)板上加入倍比稀釋的標準品、陰性對照及待測標本、辣根過氧化物酶標記的兔抗IL－6抗體及底物顯色劑，終止反應(yīng)后測A值，繪制標準曲線并求出各樣本IL－6濃度，以ng/L計。

2.7 RT－PCR檢測肺組織IL－6 mRNA表達 按說明書用 Trizol試劑提取總 RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進行PCR，PCR 25 μL 體系(2 × Taq PCR Mix 12.5 μL、上下游引物各 1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 9.5 μL)。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min，94℃ 30 s，55.4℃ 30 s，72℃ 60 s，36個循環(huán)，72℃10 min。IL－6上游引物5'－AGAGACTTCCATCCAGTTGC －3'，下游引物5'－GGTAGCATCCATCATTTCTTT －3'，擴增長度 283 bp。β－actin上游引物5'－GCCCAGAGCAAGAGAGGTATC－3'，下游引物 5'－TTGATGTCACGCACGATTTCC－3'，擴增長度467 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，凝膠成像系統(tǒng)分析測量目的基因條帶的吸光度(IA)與內(nèi)參照β－actin的IA的比值作為各個樣本的計量學(xué)指標。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差()表示，2組均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 慢性低O2高CO2誘導(dǎo)肺動脈高壓小鼠右心肥大指數(shù)升高

與對照組相比，慢性低O2高CO2組右心肥大指數(shù)［RV/(LV+S)］明顯提高，差異顯著(P ＜0.01)，見圖1。

Figure 1.Changes of right ventricular hypertrophy index［RV/(LV+S)］of mice exposed to hypoxia and hypercapnia..n=8.＊＊P＜0.01 vs control.HH:hypoxic hypercapnia group.圖1 小鼠右心肥大指數(shù)測量結(jié)果

2 慢性低O2高CO2誘導(dǎo)肺動脈高壓小鼠肺血管管壁增厚，肺血管管腔狹窄

與對照組相比，慢性低O2高CO2組肺血管管壁增厚，管腔狹窄，見圖2;肺小動脈管壁厚度占血管外徑的百分比WT%和管壁面積占血管總面積的百分比WA%明顯提高，差異顯著(P＜0.01)，見圖3。

3 慢性低O2高CO2誘導(dǎo)肺動脈高壓小鼠肺組織中IL－6蛋白表達增強

IL－6表達主要分布于肺小動脈、肺動脈內(nèi)皮細胞，與對照組相比，慢性低O2高CO2模型組肺組織中IL－6表達明顯增強，見圖4。

4 慢性低O2高CO2誘導(dǎo)肺動脈高壓小鼠肺組織中IL－6濃度提高

與對照組相比，慢性低O2高CO2組肺組織勻漿中IL－6的濃度明顯提高，差異顯著(P＜0.01)，見圖5。

5 慢性低O2高CO2誘導(dǎo)肺動脈高壓小鼠肺組織中IL－6 mRNA表達提高

與對照組相比，慢性低O2高CO2組肺組織IL－6 mRNA表達水平明顯提高，差異顯著(P＜0.05)，見圖6。

Figure 2.Structural changes in pulmonary arteries were assessed by HE staining(×400).A:control group;B:hypoxic hypercapnia group.圖2 肺組織HE染色觀察肺動脈結(jié)構(gòu)變化

Figure 3.The results of WT%(vessel wall diameter/total diameter)and WA%(vessel wall area/total area)in the lung of mice exposed to hypoxia and hypercapnia..n=8.＊＊P ＜0.01 vs control.HH:hypoxic hypercapnia.圖3 小鼠肺血管管壁厚度占血管外徑的百分比和管壁面積占血管總面積的百分比

Figure 4.The expression of IL－6 in lungs was detected by immunohistochemistry(×400).A:control group;B:hypoxic hypercapnia group.圖4 免疫組化檢測肺組織IL－6表達

Figure 5.The expression of IL－6 protein in the lung detected by ELISA..n=8.＊＊P＜0.01 vs control.HH:hypoxic hypercapnia.圖5 ELISA檢測肺組織IL－6蛋白的表達

Figure 6.The expression of IL－6 mRNA in lung was detected by RT－PCR..n=8.*P＜0.05 vs control.HH:hypoxia and hypercapnia.圖6 RT－PCR檢測肺組織IL－6mRNA的表達

討 論

肺動脈高壓是由多種原因引起的具有相似臨床癥狀和病理生理特征的一組疾病。肺動脈高壓的發(fā)病機制復(fù)雜相互交錯，與遺傳、環(huán)境因素、血管的收縮和舒張因素失衡等有關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)和肺動脈高壓密切相關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，在低氧高二氧化碳環(huán)境下，小鼠的右心肥大指數(shù)RV/(LV+S)明顯增加，肺血管壁肌層增厚和管腔狹窄，彈性纖維層所占比例增加，表明已成功建立肺動脈高壓模型，并與我們既往的實驗結(jié)果相似［2－3］。同時，在模型組小鼠的肺細小動脈上IL－6蛋白呈陽性表達，肺組織中IL－6濃度增高，肺組織中IL－6的mRNA表達增高，說明在此肺動脈高壓模型中，肺組織以及肺小動脈分泌合成的IL－6增多，并受基因水平調(diào)控。

IL－6是一種強效炎癥細胞因子，可由巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞和成纖維細胞分泌的，可誘導(dǎo)劑量依賴的平滑肌細胞增殖［4－5］，具有調(diào)節(jié)細胞的存活和改變凋亡信號等生理功能［6］。缺氧、自身免疫性抗體、病原微生物等多種因素均可導(dǎo)致IL－6表達升高，從而激活炎癥細胞和下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，啟動增殖過程和炎癥病變［7］。

臨床研究發(fā)現(xiàn)，在COPD相關(guān)肺動脈高壓、原發(fā)性肺動脈高壓中IL－6表達升高［8－9］，此外，血清IL－6水平升高亦被認為是其它類型肺動脈高壓的一個重要的危險因子［10］，如硬皮病、SLE、混合性結(jié)締組織病(mixed connective tissue disease，MCTD)、Castleman病、POEMS綜合征及HIV等疾患并發(fā)的肺動脈高壓患者中，其血或肺組織中IL－6均增高［11－13］。動物研究發(fā)現(xiàn)，注射IL－6誘導(dǎo)肺動脈高壓，IL－6加重了低氧誘導(dǎo)肺動脈高壓［11］;在野百合堿(monocrotaline)誘發(fā)的大鼠肺動脈高壓模型中，出現(xiàn)IL－6 mRNA和IL－6生物活性的不斷上調(diào)［14］;IL－6過度表達的轉(zhuǎn)基因小鼠中表現(xiàn)出肺動脈高壓血管重構(gòu)［15］;IL－6基因敲除在低O2誘導(dǎo)的肺動脈高壓模型中起到保護作用，炎癥細胞聚集減少，右室收縮壓、右室肥厚程度、肌型動脈中膜厚度均減輕［16］。目前常用慢性低氧、野百合堿注射、單純左肺切除(pneumonectomy，PE)和腹主動脈－腔靜脈分流(abdominal aortocaval fistula shunting，A－VF)等方法建立的動物模型來研究肺動脈高壓，但這些模型均不能形成人類嚴重 PH特征性的病理學(xué)改變［17］。而慢性低氧可誘導(dǎo)肺動脈高壓和肺血管重構(gòu)，高濃度的二氧化碳在肺動脈高壓形成過程中起著重要的作用，低氧高二氧化碳誘導(dǎo)肺動脈高壓符合臨床COPD患者的通氣障礙［18］。我們的實驗結(jié)果表明，在低氧高二氧化碳條件下，IL－6表達升高，伴有肺小動脈肺血管壁肌層增厚和管腔狹窄，提示肺動脈內(nèi)膜彈力纖維增厚，同時可能伴隨內(nèi)皮細胞病理性變化，結(jié)果導(dǎo)致肺血管的收縮和舒張因素失衡，而引起肺動脈結(jié)構(gòu)重建造成肺動脈高壓。我們推測IL－6表達增高可能與慢性低氧高二氧化碳誘導(dǎo)肺動脈高壓發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。具體的機制有待進一步研究。

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