柴胡皂苷在體外對人白血病細胞株K562/ADM多藥耐藥性的逆轉作用*

蓋曉東，歷 春，李 倩，劉艷波，薛昊罡

(北華大學基礎醫學院，吉林 吉林 132013)

多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是腫瘤化療失敗及腫瘤復發的重要原因。迄今至少已發現13種與MDR相關的ATP結合盒轉運體，P－糖蛋白(p－glycoprotein，P－gp)是其中最重要的一員［1］。維拉帕米、環孢霉素等常見的耐藥逆轉劑，由于正常血藥濃度難以達到療效或存在明顯的不良反應而在應用上受到限制。目前國內中藥廣泛應用于腫瘤的臨床治療，其中提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性是臨床使用中藥的一個重要目的。目前已發現多種中藥有著較好的逆轉MDR作用，其可能的機制與抑制MDR蛋白的活性、影響MDR基因的表達、促進耐藥性腫瘤細胞的凋亡等有關［2－3］。柴胡為我國傳統中藥，具有解表和里、疏肝解郁等功效，其粗提物具有逆轉腫瘤細胞MDR的作用［4］。我們在預實驗中對從柴胡中提取出的多糖(Bupleurum chinese polysaccharides，BCPS)、皂苷(Saikoside，SS)等多種組分進行篩選，結果發現SS具有MDR逆轉作用，本實驗針對SS對K562/ADM細胞MDR的逆轉作用以及初步逆轉機制進行了研究，探索該藥在抗人白血病MDR方面的應用價值。

材料和方法

1 材料

IMDM培養基為Gibco產品。四甲基偶氮唑［3－(4，5－dimethylthiazol－2 －yl)－2，5－diphenyl－tetrazolium bromide，MTT］、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)為 Sigma產品。維拉帕米(verapamil，VER)為上海市禾豐制藥有限公司產品。鹽酸多柔比星(又稱阿霉素，adriamycin，ADM)為浙江省海正藥業股份有限公司產品。超級新生牛血清為上海依科賽生物制品有限公司產品。Annexin V－FITC細胞凋亡檢測試劑盒為凱基公司產品。北柴胡(市售，經鑒定為正品北柴胡)。K562細胞和 K562/ADM細胞由吉林大學再生研究所提供。酶標儀(Tecan Genios)。流式細胞儀(Beckman)。

2 方法

2.1 柴胡皂苷提取 將柴胡在40～50℃的烘箱中烘7～8 h，充分干燥后，用植物粉碎機將其粉碎，取柴胡粉末100 g。加入70%乙醇500 mL，60℃下，回流提取2 h，抽濾，濾渣反復提取3次，減壓旋轉蒸發回收溶劑，得到浸膏，適量蒸餾水使其充分溶解后，加入水飽和正丁醇反復萃取3次。萃取液經55℃減壓旋轉蒸發除大部分溶劑后，于80℃烘箱中徹底烘干，磨碎后得到棕褐色柴胡總皂苷粉末2.8 g，收率為2.8%。

2.2 MTT法檢測SS的藥物毒性作用 分別取對數生長期的K562和K562/ADM細胞(1×108/L)，接種在96孔板內，實驗組加入不同濃度的SS(1～100 mg/L)，對照組加入等體積的培養基不加藥物。5%CO2、37 ℃培養48 h，每孔加入15 μL MTT，繼續培養4 h。2000 r/min離心5 min，傾去培養液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩 10 min，酶標儀測定 A570值，每組各設3個平行孔。確定對K562/ADM細胞抑制率≤10%的藥物濃度為SS的非細胞毒性劑量。抑制率=1－(對照孔A值－實驗孔A值/對照孔A值)×100%。

2.3 MTT法檢測SS對K562/ADM細胞逆轉作用取對數生長期K562/ADM細胞(1×108/L)接種在96孔板內，選用SS非細胞毒性劑量以下濃度1.25、2.5、5.0 mg/L和陽性對照VER 5 mg/L分別與不同濃度ADM(0.05～100 mg/L)聯合作用于K562/ADM細胞。方法同2.2測定A570值，每組各設3個平行孔。計算各組的50%抑制濃度(50%inhibitory concentration，IC50)，求出SS作用后的逆轉指數(reversal index，RI)，RI=耐藥細胞逆轉前的 IC50/耐藥細胞逆轉后的IC50。

計算2種藥物A、B相互作用系數(coefficient of drug interaction，CDI)，CDI=AB/(A × B)，A 為 A 藥物單獨作用與對照組的比值，B為B藥物單獨作用與對照組的比值，AB為兩藥共同作用與對照組的比值。CDI＜1，兩藥具有協同作用;CDI＜0.07，兩藥物具有明顯的協同作用［5－6］。

2.4 流式細胞術檢測細胞內ADM濃度 為了更有效檢測細胞內ADM濃度，我們使用的ADM濃度為50 mg/L，是ADM對K562/ADM細胞的 IC50。取對數生長期的K562/ADM細胞(4×108/L)接種在6孔板內，實驗分組如下:(1)K562/ADM;(2)K562/ADM+ADM 50 mg/L;(3)K562/ADM+ADM 50 mg/L+VER 5 mg/L;(4)K562/ADM+ADM 50 mg/L+SS 5 mg/L;(5)K562/ADM+ADM 50 mg/L+SS 2.5 mg/L;(6)K562/ADM+ADM 50 mg/L+SS 1.25 mg/L。5%CO2、37℃培養4 h，收集細胞，PBS洗2遍，依據ADM本身發熒光的特點，用流式細胞儀測定熒光強度(激發波長488 nm、發射波長575 nm)。

2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 ADM對細胞凋亡影響具有時間和劑量依賴性，50 mg/L ADM作用24 h細胞碎片較多，因此選擇10 mg/L ADM。取對數生長期 K562/ADM(4×108/L)接種6孔板中，每孔1 mL。實驗分組如下:(1)K562/ADM;(2)K562/ADM+ADM(10mg/L)+SS(1.25、2.5 和5 mg/L);(3)K562/ADM+ADM(10 mg/L)+VER(5 mg/L)。5%CO2、37℃培養24 h，收集細胞于EP管中，PBS洗1次，采用Annexin V和PI雙染法在流式細胞儀上檢測細胞凋亡(激發波長488 nm、發射波長575 nm)。

2.6 流式細胞術檢測細胞周期 取對數生長期K562/ADM細胞(4×108/L)接種6孔板中，每孔1 mL，待細胞貼壁后，實驗分組如下:(1)K562/ADM;(2)K562/ADM+ADM(50 mg/L);(3)K562/ADM+ADM(50 mg/L)+VER(5 mg/L);(4)K562/ADM+ADM(50 mg/L)+SS(1.25、2.5 和 5 mg/L)。5%CO2、37℃培養4 h，收集細胞，70%乙醇4℃過夜，PBS洗2次，流式細胞儀檢測細胞周期(激發波長488 nm、發射波長575 nm)。

3 統計學處理

采用SPSS 11.0軟件進行統計處理，數據用均數±標準差()表示，多樣本間均數比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計意義。

結 果

1 SS對K562和K562/ADM細胞的毒性作用

SS(1～100 mg/L)6個濃度作用48 h后，隨著濃度的增加，K562和K562/ADM細胞的增殖抑制率也相應增加，呈劑量－效應關系，見圖1。SS對K562/ADM細胞的非細胞毒性劑量為5.0 mg/L，抑制率＜10%。因此，選擇SS非細胞毒性劑量以下的濃度作為最佳藥物逆轉濃度。SS對K562和K562/ADM細胞的IC50值分別為9.25 mg/L和29.9 mg/L。

Figure 1.Inhibitory rates of the proliferation of K562 and K562/ADM cells after treated with SS.圖1 SS作用下K562和K562/ADM細胞的增殖抑制率

2 SS對K562/ADM細胞MDR的逆轉作用

SS的非細胞毒性劑量為5.0 mg/L，取1.25 mg/L、2.5 mg/L和5.0 mg/L與不同濃度的ADM(0.05～100 mg/L)聯合作用于K562/ADM細胞進行逆轉作用研究，測定IC50。從表1可以看出3個濃度的SS與不同濃度ADM的聯合作用均可使K562/ADM的IC50明顯下降，呈現劑量依賴性，與逆轉前IC50比較均有顯著差異(P＜0.01)。其中以5.0 mg/L SS逆轉效果最佳，逆轉指數達到21.5倍，而陽性逆轉劑VER的逆轉倍數為13.5倍。

表1 SS與ADM聯合作用下K562/ADM細胞株耐藥性的逆轉指數Table 1.Reversal index(RI)of K562/ADM cells after treated with SS and ADM(.n=3)

表1 SS與ADM聯合作用下K562/ADM細胞株耐藥性的逆轉指數Table 1.Reversal index(RI)of K562/ADM cells after treated with SS and ADM(.n=3)

*P ＜0.05 vs ADM group.

ADM 0 49.53 ±3.10—13.5 ADM+SS 1.25 5.93 ±0.12* 8.42.5 4.98 ±0.13* 10.05.0 2.31 ±0.36* 21.5 ADM+VER 5.0 3.67 ±0.33*

3 SS與ADM的協同作用

經計算，SS濃度為1.25、2.5和5.0 mg/L各組的CDI值分別為0.92、0.89和0.82，均 ＜1，表明 SS與ADM具有協同作用。

倒置顯微鏡下觀察細胞形態，SS協同ADM作用后，腫瘤細胞除了增殖受到抑制外，也出現了大量凋亡細胞，表現為細胞胞漿濃縮、體積縮小、核碎裂呈小塊，呈劑量－效應關系，見圖2。

Figure 2.The morphology of K562/ADM cells after treated with different concentrations of SS and ADM for 48 h.A:K562/ADM;B:SS 1.25 mg/L+ADM 5 mg/L;C:SS 2.5 mg/L+ADM 5 mg/L;D:SS 5 mg/L+ADM 5 mg/L.圖2 不同濃度的SS與ADM作用K562/ADM細胞48 h后的形態

4 SS作用下K562/ADM細胞內ADM濃度的變化

不同濃度非細胞毒性劑量SS聯合ADM分別作用于K562/ADM細胞4 h后，隨著SS濃度的增加K562/ADM細胞內ADM熒光強度相應增加，與ADM單獨作用的K562/ADM細胞比較差異顯著(P＜0.05)，陽性對照VER也可明顯增加K562/ADM細胞內ADM熒光強度(P＜0.05)。而不同濃度非細胞毒性劑量SS聯合ADM作用于K562細胞后，各組細胞內ADM熒光強度與ADM單獨作用的K562細胞比較無明顯差異(P＞0.05)，見表2。提示SS可增加K562/ADM細胞內ADM的蓄積。

5 SS對K562/ADM細胞凋亡的影響

在不同濃度的非細胞毒性劑量SS聯合ADM作用K562/ADM細胞24 h后，各組細胞凋亡率與單用ADM組相比均明顯增加(P＜0.05)，可見非細胞毒性劑量SS能夠增強ADM對K562/ADM細胞的凋亡誘導作用，見圖3。

6 SS作用下細胞周期時相分布的變化

ADM單獨作用于K562/ADM細胞4 h后與對照組相比，G0/G1期細胞明顯增加，S期細胞明顯減少(P＜0.05)。當ADM分別與不同濃度的非細胞毒性劑量SS作用K562/ADM細胞4 h后，各組細胞與ADM單獨作用比較G0/G1期細胞均明顯增加，S期細胞明顯減少(P＜0.05)，表明SS具有增加ADM作用于K562/ADM細胞的G0/G1期增殖阻滯作用，見表3。

表2 SS與ADM聯合作用下K562/ADM細胞內ADM濃度的變化Table 2.The changes of ADM level in K562/ADM cells after treated with SS and ADM(.n=3)

表2 SS與ADM聯合作用下K562/ADM細胞內ADM濃度的變化Table 2.The changes of ADM level in K562/ADM cells after treated with SS and ADM(.n=3)

*P ＜0.05 vs ADM group(K562/ADM).

Group K562/ADM K56256.20 ±3.89 ADM 22.80 ±2.39 50.70 ±2.67 ADM+SS 1.25 mg/L 31.90 ±2.04* 54.30 ±2.122.5 mg/L 35.20 ±1.98* 53.10 ±1.895.0 mg/L 38.50 ±2.56* 53.90 ±2.92 ADM+VER 46.70 ±2.24*

Figure 3.The apoptosis of K562/ADM after treated with SS and ADM.1:K562/ADM+ADM 10 mg/L;2:K562/ADM+ADM 10 mg/L+VER 5 mg/L;3:K562/ADM+ADM 10 mg/L+SS 1.25 mg/L;4:K562/ADM+ADM 10 mg/L+SS 2.5 mg/L;5:K562/ADM+ADM 10 mg/L+SS 5 mg/L.*P ＜0.05 vs group 1.圖3 SS聯合ADM對K562/ADM細胞凋亡的影響

表3 SS聯合ADM作用下K562/ADM細胞細胞周期變化Table 3.The changes of cell cycle of K562/ADM cells after treated with SS and ADM(%..n=3)

表3 SS聯合ADM作用下K562/ADM細胞細胞周期變化Table 3.The changes of cell cycle of K562/ADM cells after treated with SS and ADM(%..n=3)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs ADM group.

Group G0/G1S Control 24.80 ±5.64 72.30 ±2.98 ADM 32.90 ±3.29* 61.50 ±3.65*ADM+SS 1.25 mg/L 41.50 ±3.94*# 52.10 ±4.77*#2.5 mg/L 49.60 ±4.67*# 46.60 ±3.95*#5.0 mg/L 55.70 ±5.28*# 34.20 ±5.74*#ADM+VER 49.60 ±4.76*# 42.30 ±4.21*#

討 論

白血病MDR是白血病化療的一大障礙，克服白血病MDR，提高抗癌藥物療效已經成為白血病治療亟待解決的關鍵性課題。體外被證實具有逆轉耐藥活性的化合物或生物制劑有很多，如環胞霉素、異博定等，但因它們對心、腎的毒性，使其臨床應用受到限制。研究白血病MDR，尋找有效低毒的逆轉劑，一直是人們感興趣的研究課題。

自從Tsuruo等［7］報道異搏定具有逆轉腫瘤多藥耐藥以來，相繼發現了數種化療藥物逆轉劑，特別是鈣通道阻滯劑(calcium channel blocker，CCB)藥物逆轉效果最為可靠，但化學藥物因本身的毒副作用限制其臨床應用。柴胡具有和解泄熱、疏肝解郁和抗腫瘤等作用，其粗提物具有逆轉腫瘤細胞多藥耐藥的作用［4］。SS是從柴胡中提取的有效活性成分，毒性小，非毒劑量的SS 1.25、2.5和5 mg/L能夠增強K562/ADM細胞對ADM的敏感性，使其對ADM的IC50明顯下降，逆轉倍數分別為8.4倍、10.0倍和21.5倍，表明SS能部分逆轉K562/ADM細胞的耐藥性。細胞形態觀察也證實了非毒劑量的SS協同ADM作用后，腫瘤細胞除了增殖受到抑制外，也出現了大量的凋亡細胞。同時CDI值分別為0.92、0.89和0.82，均小于1。表明SS與ADM具有協同作用。

因ADM能自發熒光，細胞內ADM熒光強度與細胞內ADM濃度呈正相關，即熒光強度可以反映細胞內ADM濃度［8］。本研究結果顯示:SS聯合ADM作用K562/ADM細胞后，細胞內的熒光強度明顯提高，提示SS可以增加K562/ADM細胞中ADM的蓄積。MDR的形成機制錯綜復雜，包括經典耐藥標志蛋白P－gp、細胞周期調控異常、凋亡基因表達失控及DNA 修復能力增強等因素［9－10］。

研究表明，腫瘤細胞獲得MDR主要的機制之一就是通過逃逸凋亡或拮抗凋亡而獲得的。因此，誘導MDR腫瘤細胞凋亡，可為腫瘤治療提供新的靶點［11－13］。我們的研究也證實了 SS可以使 ADM 作用下的K562/ADM細胞凋亡率明顯增加，從而提高K562/ADM細胞對ADM敏感性，逆轉腫瘤細胞的MDR。細胞周期實驗結果顯示，SS處理后G0/G1期細胞明顯增加，G2/M期的分裂受到了抑制。G1期為細胞分化期，也是藥物作用的敏感期，提示SS逆轉作用可能是通過將K562/ADM細胞阻滯在G0/G1期而發揮作用。

綜上所述，SS對K562/ADM細胞具有一定的增殖抑制和逆轉作用，其逆轉作用可能是通過增加細胞內化療藥物的蓄積，誘導細胞凋亡和將 K562/ADM細胞阻滯在G0/G1期從而抑制其增殖，其它相關逆轉機制有待進一步研究。

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