黃芩苷對CA46細胞裸鼠異種移植瘤的作用及機制*

黃 毅，胡建達，鄭 靜，李 靜，魏天南，鄭志紅，陳英玉

(福建醫科大學1附屬協和醫院，福建省血液病研究所，2省立臨床醫學院，福建 福州 350001)

黃芩苷在體外可抑制多種腫瘤細胞的增殖［1－4］，體內研究同樣顯示黃芩苷具有明顯的抗腫瘤活性。Ikemoto等［5］對C3H/HeN鼠行皮下移植鼠膀胱腫瘤－2(mouse bladder tumor－2，MBT－2)細胞致瘤，每天以10 mg的黃芩提取物灌胃處理1次，共10 d，于第20 d和第25 d測得的瘤體積明顯小于對照組;而體外實驗表明黃芩苷是黃芩提取物中發揮抗MBT－2膀胱癌細胞增殖的最主要活性成分。此外，黃芩苷對A549肺癌、艾氏腹水瘤、黑色素瘤的小鼠腫瘤模型也具有明顯的抑制作用［6－8］。我們前期體外實驗結果表明黃芩苷能明顯抑制人Burkitt淋巴瘤CA46細胞的增殖并誘導凋亡［9］，在此基礎上，本研究擬建立CA46細胞裸鼠異種移植瘤模型，進一步探討黃芩苷體內抗Burkitt淋巴瘤的作用及其可能機制，目前國內外尚未見相關報道。

材料和方法

1 細胞培養體系和藥物

高致瘤CA46細胞引自中國醫學科學院天津血液病研究所，由福建省血液病研究所傳代保存，用含10%胎牛血清(Gibco)的RPMI－1640培養液(Gibco)，置37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養，2～3 d換液傳代1次;實驗用細胞為狀態良好的對數生長期細胞。黃芩苷購自南京青澤醫藥科技開發有限公司，5%NaHCO3溶解備用;依托泊甙(etoposide，VP－16)為上海華聯制藥有限公司產品，環磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)為江蘇恒瑞醫藥股份有限公司產品，均以雙蒸水溶解備用。

2 動物

6～8周齡的BABL/c裸鼠，體重16～18 g，雌雄各半，購自中國醫學科學院上海實驗動物繁育中心，為無特殊致病菌(specific pathogen－free，SPF)動物，合格證號為SCXK(滬)2007－0005。所有裸鼠在福建醫科大學實驗動物中心(許可證號為SYXK閩2008－0001)SPF層流柜中飼養。

3 CA46細胞裸鼠異種移植瘤模型的建立及實驗分組

飼養第3 d開始對每只裸鼠行腹腔注射10 g/L環磷酰胺0.2 mL，1次/d，連續2 d;第5 d收集對數生長期的高致瘤CA46細胞，在每只裸鼠右后背側皮下接種0.2 mL細胞懸液(8×106個細胞/只)，7 d后觀察成瘤率達100%，選擇腫瘤直徑0.5～0.6 cm的裸鼠進行實驗。將荷瘤裸鼠隨機分為5%NaHCO3陰性對照組、陽性對照組(4 mg/kg VP－16)以及黃芩苷高(60 mg/kg)、中(30 mg/kg)、低(15 mg/kg)3個濃度用藥組，每組12只裸鼠，雌雄各半，均采用腹腔注射方式給藥，每次0.2 mL，每天1次，連續12 d。

4 給藥12 d后檢測的指標

4.1 體重、血常規及肝、腎功能的檢測 末次給藥后24 h，每組均隨機取出6只裸鼠，雌雄各半，留下的6只裸鼠用以觀察荷瘤生存時間。對取出的裸鼠行體重稱量后，每只腹腔注射0.5%肝素0.5 mL，使之肝素化，5～6 min后摘除眼球取血，一部分肝素抗凝全血用以檢測血常規中白細胞 (leukocyte，Leu)、血紅蛋白 (haemoglobin，Hb)和血小板 (platalet，Plt)的濃度;另一部分離心分離出血漿用以檢測肝功能中丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、γ－谷氨酰轉移酶 (γ－glutamyltransferase，γ－GT)和腎功能中血尿素氮 (blood urea nitrogen，BUN)、肌酐 (creatinine，Cr)的濃度。

4.2 抑瘤率的檢測 取血后，頸椎脫臼處死裸鼠，立即完整剝離瘤塊，稱量離體瘤塊重量，計算各組平均瘤塊重量及抑瘤率。抑瘤率(%)=［1－(給藥組平均瘤重/陰性對照組平均瘤重)］×100%。

4.3 透射電鏡觀察瘤組織細胞的超微結構 切取各組裸鼠的部分新鮮瘤塊，1 mm×1 mm×1 mm大小數塊，迅速放入4℃預冷的2.5%戊二醛和1%多聚甲醛混合固定液中固定，1%鋨酸固定后，環氧樹脂618包埋，超薄切片，用醋酸鈉和枸櫞酸銅染色，日立HU－12A型透射電鏡下觀察瘤組織細胞的超微結構。

4.4 病理組織學檢查 分別切取各組裸鼠的部分新鮮瘤塊置10%甲醛中固定后，常規制作石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察。

4.5 Western blotting檢測瘤塊組織蛋白激酶B(protein kinase，Akt)、磷酸化 Akt(phospho－Akt，p－Akt)、核因子 －κB(nuclear factor－kappa B，NF－κB)p65、哺乳動物雷帕霉素靶點 (mammalian target of rapamycin，mTOR)、磷酸化 mTOR(phosphomTOR，p－mTOR)蛋白的表達 將切取的各組裸鼠新鮮瘤塊組織充分研磨，過濾后提取蛋白，以β－actin蛋白為內參照，采用Western blotting檢測各組相應蛋白表達的變化;所用β－actin鼠抗購自NeoMarkers，Akt、p － Akt(Ser32)、mTOR 和 p － mTOR(Ser2448)兔抗購自 Cell Signaling Technology，NF－κB p65兔抗購自 eBioscience，操作步驟詳見文獻［9］。

5 荷瘤裸鼠生存時間觀察

從首次給藥時間算起繼續對各組留下觀察生存時間的荷瘤裸鼠行腹腔注射藥物，每次0.2 mL，2 d 1次，直至裸鼠全部死亡，期間對每只裸鼠的生存時間均予以記錄，計算各組荷瘤裸鼠不同階段的生存率和生存延長率。生存延長率(%)=(給藥組平均生存時間－陰性對照組平均生存時間)/陰性對照組平均生存時間×100%。

6 統計學處理

結 果

1 黃芩苷對荷瘤裸鼠血常規、肝腎功能和體重的影響

腹腔注射12 d后，陽性對照組(4 mg/kg VP－16)荷瘤裸鼠的白細胞數為(8.4±2.1)×109/L，明顯低于陰性對照組的(11.6±2.0)×109/L(P＜0.05);而30 mg/kg和60 mg/kg黃芩苷給藥組血常規、肝腎功能和體重的檢測結果與陰性對照組比較無顯著差異(P＞0.05)，見表1。

2 黃芩苷對CA46細胞裸鼠異種移植瘤生長的抑制作用

腹腔注射黃芩苷12 d后處死各組部分裸鼠取瘤塊稱重的結果顯示，30 mg/kg黃芩苷組、60 mg/kg黃芩苷組瘤塊重量均明顯低于陰性對照組(P＜0.05，P＜0.01)，抑瘤率分別為28.4%和51.9%，呈現劑量依賴性，提示黃芩苷對CA46細胞裸鼠異種移植瘤的生長具有明顯的抑制作用，見圖1、表2。

表1 給藥12 d后裸鼠的血常規、肝腎功能和體重檢測結果Table 1.The results of blood，liver and renal function assay，and body weight in nude mice with CA46 cell xenografts after drug injection for 12 d(.n=6)

表1 給藥12 d后裸鼠的血常規、肝腎功能和體重檢測結果Table 1.The results of blood，liver and renal function assay，and body weight in nude mice with CA46 cell xenografts after drug injection for 12 d(.n=6)

*P ＜0.05 vs negative control group.

Index Negative control 30 mg/kg baicalin 60 mg/kg baicalin Positive control(4 mg/kg VP－16)Leukocyte(×109/L) 11.6 ±2.0 11.9 ±1.7 11.4 ±1.8 8.4 ±2.1*Hb(g/L) 117.3 ±10.6 116.5 ±11.3 120.7 ±12.6 106.5 ±9.2 Platelet(×109/L) 1098.3 ±194.6 1103.1 ±167.3 1078.8 ±157.3 1002.5 ±159.3 ALT(U/L) 64.5 ±8.3 61.3 ±11.8 66.7 ±11.6 63.8 ±8.8 γ － GT(U/L) 51.8 ±8.6 57.5 ±10.1 52.8 ±7.5 55.5 ±6.5 BUN(mmol/L) 7.1 ±0.7 7.2 ±0.8 6.9 ±1.2 7.0 ±1.0 Cr(μmol/L) 61.5 ±10.2 65.2 ±12.2 59.5 ±10.7 62.2 ±13.0 Body weight(g)22.6 ±2.4 22.3 ±2.5 21.9 ±2.8 21.2 ±3.1

Figure 1.The CA46 cell xenografts in all groups after drug injection for 12 d.圖1 給藥12 d后各組裸鼠的瘤塊大小

表2 給藥12 d后各組瘤塊重量及抑瘤率比較Table 2.The weight and inhibitory rate of CA46 cell xenografts in all groups after drug injection for 12 d(.n=6)

表2 給藥12 d后各組瘤塊重量及抑瘤率比較Table 2.The weight and inhibitory rate of CA46 cell xenografts in all groups after drug injection for 12 d(.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs negative control group.

Group Weight(g) Inhibitory rate(%)53.6 Negative control 1.83 ±0.19 －15 mg/kg baicalin 1.74 ±0.17 4.930 mg/kg baicalin 1.31 ±0.37* 28.460 mg/kg baicalin 0.88 ±0.42＊＊ 51.9 Positive control(4 mg/kg VP －16) 0.85 ±0.44＊＊

3 透射電鏡觀察瘤塊組織細胞的超微結構

30 mg/kg黃芩苷組、60 mg/kg黃芩苷組和陽性對照組(4 mg/kg VP－16)的瘤塊組織經透射電鏡觀察，瘤細胞凋亡現象多見，形態特點如下:核染色質固縮，聚集于核膜下，呈界限分明的顆粒狀或半月形小體，胞漿固縮;相比之下，陰性對照組瘤細胞排列密集，形態正常，細胞核染色質呈均質狀，見圖2。

4 瘤塊病理組織學改變

光鏡下觀察，可見30 mg/kg黃芩苷組、60 mg/kg黃芩苷組和陽性對照組(4 mg/kg VP－16)瘤塊組織中的瘤細胞明顯減少，細胞體積變小，核深染，有的細胞固縮，有的僅存胞核，可見不規則壞死、出血;相比之下，陰性對照組瘤細胞排列密集，瘤細胞形態正常，呈圓形或橢圓形、大小均一，見圖3。

Figure 2.The cell ultrastructure of CA46 cell xenografts in nude mice after drug injection for 12 d(×6300).A:negative control group;B:30 mg/kg baicalin group;C:60 mg/kg baicalin group;D:positive control(4 mg/kg VP－16)group.→:apoptosis.圖2 給藥12 d后瘤塊細胞超微結構

Figure 3.The pathological changes of CA46 cell xenografts in nude mice after drug injection for 12 d(×200).A:negative control group;B:30 mg/kg baicalin group;C:60 mg/kg baicalin group;D:positive control(4 mg/kg VP－16)group.→:necrosis and hemorrhage.圖3 給藥12 d后瘤塊病理變化

5 Western blotting 檢測瘤塊組織 Akt、p －Akt、NF－κB、mTOR和p－mTOR蛋白的表達

給藥12 d后，30 mg/kg黃芩苷組和60 mg/kg黃芩苷組瘤塊組織 p－Akt、NF－κB、mTOR和 pmTOR蛋白的表達水平均明顯低于陰性對照組(P＜0.05，P＜0.01)，呈劑量依賴性;而 Akt的表達無明顯改變，見圖 4、5。

6 荷瘤裸鼠生存時間觀察

陰性對照組荷瘤裸鼠的生存時間僅(49.7±14.6)d，至71 d即全部死亡;而黃芩苷用藥組隨著藥物劑量的增加，裸鼠的生存時間得到延長:30 mg/kg組的生存時間(62.2±17.0)d，生存延長率25.2%;60 mg/kg組的生存時間(70.8±19.1)d，生存延長率42.4%，與陰性對照組比較差異顯著(P＜0.05)，見圖6。

討 論

Figure 4.The expression of Akt，p － Akt，NF － κB，mTOR and p－mTOR proteins，in CA46 cell xenografts in nude mice after drug injection for 12 d.Lane 1:negative control group;Lane 2:30 mg/kg baicalin group;Lane 3:60 mg/kg baicalin group;Lane 4:positive control(4 mg/kg VP －16)group.圖4 給藥12 d后瘤塊組織 Akt、p－Akt、NF－κB、mTOR和p－mTOR蛋白表達的變化

Figure 5.The comparison of Akt，p －Akt，NF － κB，mTOR and p－mTOR protein expression of CA46 cell xenografts in nude mice after drug injection for 12 d.β－actin protein was used as an internal control..n=6.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs negative control group.圖5 給藥12 d后瘤塊組織 Akt、p－Akt、NF－κB、mTOR和p－mTOR蛋白相對灰度值的比較

Figure 6.The Kaplan－Meier survival curves of nude mice with CA46 cell xenografts in all groups.n=6.圖6 各組荷瘤裸鼠Kaplan－Meier生存曲線

自1969年Rygarrd首次在裸鼠身上成功移植人類腫瘤后，裸鼠異種移植瘤模型就成為人們進行腫瘤實驗性治療廣泛采用的研究手段，人體內腫瘤與人腫瘤細胞裸鼠異種移植瘤對藥物反應的一致性已獲得證實［10］。本實驗結果顯示，對建立的CA46細胞裸鼠異種移植瘤行腹腔注射方式給藥12 d后，30 mg/kg黃芩苷組和60 mg/kg黃芩苷組的抑瘤率達到28.4%和51.9%，提示黃芩苷具有明顯的體內抗Burkitt淋巴瘤活性，且作用呈現劑量依賴性，在一定范圍內濃度越高，抑瘤作用越明顯。生存時間是評價抗腫瘤藥物療效的最可靠指標之一，本研究結果發現黃芩苷作用還可延長荷瘤裸鼠的生存時間，30 mg/kg黃芩苷和60 mg/kg黃芩苷將裸鼠的生存時間分別延長了25.2%和42.4%，且60 mg/kg黃芩苷組的生存時間與陰性對照組相比較差異顯著(P＜0.05)。腫瘤的形成和發展是十分復雜的過程，涉及多種細胞因子和信號通路的改變，單純依靠黃芩苷在治療的后期難以控制腫瘤的生長，將黃芩苷與其它化療藥物聯用，能否減少腫瘤的耐藥性，進一步提高荷瘤裸鼠的生存時間有待探討。

細胞死亡方式有2種:一是凋亡，它是散在于腫瘤組織中的單個細胞或小細胞團的死亡，死亡細胞的染色質凝集，嗜堿性染色增強，然后細胞核崩解，但細胞的質膜不破裂、不引發急性炎癥反應;二是壞死，它是腫瘤內范圍不等的局部細胞死亡，死亡細胞的質膜崩解、組織自溶，并引發急性炎癥反應［11］。本研究采用透射電鏡法和病理組織學法觀察黃芩苷作用后裸鼠瘤塊組織的變化，結果發現30 mg/kg組和60 mg/kg組腫瘤細胞凋亡和壞死現象多見，而陰性對照組偶見凋亡和壞死細胞，提示黃芩苷一方面可誘導腫瘤細胞凋亡，另一方面又可引起腫瘤細胞壞死，通過上述2種方式促進腫瘤細胞死亡而發揮體內抗Burkitt淋巴瘤的作用。

PI3K/Akt是體內重要的信號通路之一，在介導細胞的增殖、存活和凋亡中發揮重要的調節作用。近來的研究表明，該通路的持續活化可導致細胞凋亡通路受阻，或細胞周期進程加快，使正常細胞向腫瘤細胞轉化，與血液系統惡性腫瘤的發生發展及治療密切相關［12］。Akt是PI3K/Akt信號通路的主要調節分子，通過磷酸化而激活，而轉錄因子NF－κB和控制翻譯蛋白mTOR是其下游的兩個重要靶分子，也是抗血液系統惡性腫瘤治療上的重要作用靶點［12－13］。本研究結果顯示黃芩苷明顯抑制了瘤塊組織Akt的磷酸化，并導致NF－κB和mTOR表達水平的下降及mTOR磷酸化的受阻，提示黃芩苷體內抗Burkitt淋巴瘤作用的機制可能與下調PI3K/Akt/NF－κB和PI3K/Akt/mTOR信號通路有關。

藥物濃度超過一定范圍會帶來毒副作用，通常表現在對胃腸道、造血系統及肝腎功能的影響上。本研究在給藥12 d期間觀察成瘤裸鼠一般狀況，高、中、低3種濃度黃芩苷給藥組均未見裸鼠有消瘦、厭食、活躍程度下降等明顯異常;給藥12 d后的血常規和肝腎功能檢測結果顯示，30 mg/kg和60 mg/kg黃芩苷給藥組和陰性對照組比較均無顯著差異(P＞0.05)，提示在本給藥劑量下，黃芩苷對CA46細胞具有選擇性殺傷作用，而對裸鼠正常血細胞和肝、腎器官無明顯毒副作用。相比之下，陽性對照組荷瘤裸鼠的白細胞數明顯低于陰性對照組(P＜0.05)，推測與VP－16具一定的骨髓抑制性有關。

細胞增殖和凋亡是一個由多因素、多分子參與的復雜過程。黃芩苷在體內抑制CA46細胞裸鼠異種移植瘤生長并誘導腫瘤細胞凋亡的過程，是否有其它信號通路，以及Akt下游其它靶分子的參與，有待進一步研究。

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