手工密閉式制備冰凍解凍去甘油紅細胞方法研究

王萬仲

(紅河州中心血站 云南蒙自 661100)

血液的深低溫保存已經取得了較好的臨床應用效果,甘油作為細胞內低溫保護劑,保證了紅細胞在深低溫環境下不易溶血。紅河州中心血站自2009年開展了紅細胞的冷凍保存工作,最初在無菌室開放式操作,存在細菌污染血液的風險。紅細胞甘油化時采用來回式振蕩器混合搖勻,解凍洗滌時用羥乙基淀粉洗滌法[1]洗滌,但上述方法耗時間、耗人力、溶血率高,效果不理想,難以滿足臨床緊急用血的需要。據此,筆者參考美國ACP215全自動細胞洗滌機的方法[2],使用無菌接合機無菌接駁在密閉環境下手工制備冰凍紅細胞及解凍復蘇洗滌,取得了滿意的效果,最終制品的質量檢測結果符合中華人民共和國全血及成分血質量標準[3]。

1 材料與設備

1.1 材料

復方甘油溶液,規格160mL,Rh(-)懸浮紅細胞,一次性200mL轉移袋,分漿夾,一次性輸血器,一次性使用單采血細胞分離器800mL轉移袋,9%Nacl溶液,規格80mL,三聯袋0.9%Nacl溶液,規格750mL。

1.2 設備

水平旋轉式細胞混合搖床,恒溫循環水溶箱,無菌接合機,-70℃以下專用低溫冰箱,大型低溫離心機。

2 操作方法

2.1 紅細胞甘油化

2.1.1 分上清 懸浮紅細胞用無菌接合機接駁一個200mL一次性轉移袋,稱量平衡置于CR7離心機中,3000rpm離心10min,在分夾中分離出上清液,得壓積紅細胞,用塑料止流夾夾住連通管路,搖勻得壓積紅細胞。

2.1.2 加注甘油 按照懸浮紅細胞標識量1、1.5、2u分別加入復方甘油溶液160、240、320mL。具體操作方法:將復方甘油溶液袋的游離管路和輸血器入口端的管路無菌接合、懸浮紅細胞袋的游離管路和輸血器出口端管路無菌接合,通過輸血器滴速控制滾輪控制甘油滴速向血袋內緩慢注入復方甘油溶液,血袋放置在水平旋轉式細胞混合搖床上混勻,加注前5min滴速不超過3mL/min,5min后滴速增加到4～6mL/min,加注完畢室溫下水平靜置30min以上。

2.1.3 分離多余的甘油 甘油化的紅細胞稱量平衡,2000rpm離心5min,分漿夾中分離出未進入紅細胞內多余的甘油轉移入200mL轉移袋內,熱合、斷袋。

2.1.4 倒袋 將甘油化紅細胞袋游離管路和一次性使用單采血細胞分離器800mL轉移袋游離管路無菌接駁,紅細胞倒入800mL轉移袋內,熱合、斷袋,電腦登記入庫打印血袋流水號標簽粘貼。

表1 冰凍解凍去甘油紅細胞質量檢測結果(n=31,s)

表1 冰凍解凍去甘油紅細胞質量檢測結果(n=31,s)

紅細胞回收率(%)31 81.66±2.33 ≥80上清液甘油含量(g/L)31 1.93±0.49 ≤10殘余白細胞(%)31 0.85±1.21 ≤1殘余血小板(%)31 0.63±0.24 ≤1上清液游離血紅蛋白含量(g/L)31 0.32±0.18 ≤1體外溶血率(%)31 16.33±4.48 ≤50

2.1.5 冰凍保存 甘油化紅細胞放入特制防護紙盒內,立即放入-50℃速凍機進行速凍,速凍完畢立即放入-65℃以下深低溫冰箱保存,得冰凍紅細胞。

2.2 冰凍解凍去甘油紅細胞制備

2.2.1 復蘇解凍 從冰箱中取出冰凍紅細胞去除外包裝盒,直接放入39℃循環水溶箱中解凍,溶解時雙手水平勻速搖動血袋,溶解完畢,室溫水平靜置5min,留取一根試管血作為質量檢測標本。

2.2.2 第1次洗滌 血袋游離管路和9%NaCl溶液游離管路無菌接駁,向血袋內注入9%NaCl溶液,1、1.5、2u分別注入80、140、160mL,滴速為80ml/min,血袋置于水平旋轉式細胞混合搖床上邊注邊搖勻,注完后熱合、斷袋,水平靜置5min。無菌接駁一套三聯袋0.9%Nacl溶液,以80mL/min注入0.9%的NaCl350mL,邊注邊搖勻,注完后水平靜置5min,以3000rpm離心10min,分漿夾中去上清液。

2.2.3 第2次洗滌 以80mL/min向血袋內注入0.9%NaCl400mL,邊注邊搖勻,注完后水平靜置5min,以3000rpm離心,分漿夾中去上清液,熱合、斷袋。

2.2.4 第3次洗滌 無菌接駁一套三聯袋0.9%Nacl溶液,以80mL/min向血袋內注入0.9%NaCl150mL,邊注邊搖勻,以3000rpm離心10min,分漿夾中去上清液。

2.2.5 第4次或4次以上洗滌 按照2.2.4方法操作,直至離心后上清液清亮為止。

2.2.6 冰凍解凍去甘油紅細胞制品 洗滌后的紅細胞加入0.9%NaCl溶液懸浮,1、1.5、2u最終容量分別為(200±20)、(300±30)、(400±40)mL,搖勻,留取一根試管血作為質量檢測標本,使用搟血鉗將紅細胞逆流至血袋塑料管內,熱合5cm長兩段血作配血標本,電腦登記入庫打印血袋標簽粘貼,得解凍去甘油紅細胞制品,包裝好供應臨床。

2.3 數據檢測

采用細胞計數儀檢測紅細胞回收率、殘余白細胞、殘余血小板,Trinder法檢測上清液游離血紅蛋白含量及體外溶血率,過碘酸鈉法檢測上清液甘油含量。

3 結果

共制備解凍去甘油紅細胞31袋計51u,其質量檢測結果見表1。所有血液全部供應臨床,共計30多人次輸血,經輸血后觀察無不良反應發生,無血紅蛋白尿、腎功能受損等,取得良好的臨床效果(表1)。

4 討論

紅細胞在甘油化及解凍去甘油的過程是影響紅細胞溶血最為關鍵的因素,如何在制備過程中保證血液質量,同時簡化操作流程是廣大血液工作者追求的目標。紅細胞甘油化時,筆者使用的是利用輸血器嚴格控制甘油滴速,加注時采取先慢后快的原則,縮小細胞內外滲透壓平衡時間,再使用水平旋轉式細胞混合搖床代替來回式振蕩器混勻血袋,保證甘油進入血袋內迅速擴散,大大降低了甘油進入血袋內由于高滲透壓導致的細胞膜破裂溶血;在解凍洗滌去甘油時,筆者采用兩種梯度的鹽水洗滌、平衡靜置等使紅細胞緩慢從高滲到等滲狀態的轉變,有效降低了滲透壓梯度的急劇變化引起的紅細胞溶血;此外,整個洗滌過程中筆者均使用無菌接合機接駁各種溶液袋子之間的連通,保證血液在全封閉環境下制備,防止了在無菌室開放式制備細菌污染的機會,整個制備過程只需由一位工作人員操作。終產品經質量檢測結果證實各項檢測指標均符合國家標準,尤其適合中小型血站、偏遠地區血站的開展,值得大力推廣應用。

[1]徐國泰,呂秋霜,王春榮,等.羥乙基淀粉溶液洗滌法—快速洗滌冷凍紅細胞[J].中國輸血雜志,1988,1(4):191.

[2]金志堅,王擁軍,徐芳,等.細胞洗滌機去甘油化技術的應用[J].中國輸血雜志,2006,19(1):55.

[3]中化人民共和國.國家標準GB18469-2001.全血及成分血質量要求[S].北京:中國醫療出版社,2002:7～8.