供體應(yīng)用鈣調(diào)磷酸酶抑制劑預(yù)處理減少大鼠腎移植缺血再灌注損傷及機(jī)制

唐 建 徐 達(dá) 王祥慧 周佩軍

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院移植中心，上海 200025

缺血再灌注損傷在腎移植領(lǐng)域是無法避免的事件。這一事件使得移植物抗原暴露，增加了移植物免疫原性。對(duì)移植腎的影響一方面增加早期移植腎功能延遲恢復(fù)及排斥反應(yīng)的發(fā)生率，另一方面也與移植腎長期預(yù)后相關(guān)[1]。因此，積極尋找某種策略來減少移植過程中缺血再灌注損傷的發(fā)生就顯得尤為重要。較缺血性預(yù)處理相比，藥物性預(yù)處理具有無創(chuàng)、對(duì)機(jī)體損傷小的優(yōu)勢(shì)，其應(yīng)用潛力巨大。因此，筆者設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)，初步探討供體應(yīng)用鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（CNIs）類藥物預(yù)處理對(duì)腎移植缺血再灌注損傷的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

大鼠 TNF-a ELISA 試劑盒（R＆D systems，美國）；大鼠HSP-70 ELISA 試劑盒（R＆D systems，美國）；酶標(biāo)儀（Labsystems Multiskan MS，芬蘭）；自動(dòng)生化分析儀（Hitachi 7000，日本）；組織勻漿器（Pro Scientific，美國）；環(huán)孢素 A（Novartis Pharma GmbH，德國）；他克莫司（Astellas，日本）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性Lewis近交系大鼠，體重220～280 g，不限飲食。按供受體隨機(jī)分為3組：環(huán)孢素A組（CsA，10 mg/kg）、他克莫司組（Tac，1 mg/kg）、生理鹽水對(duì)照組，每組8對(duì)大鼠。另設(shè)單腎切除組（n=8）作為空白對(duì)照。腎移植24 h前各組中供體作如下預(yù)處理（表1）。

1.3 供體手術(shù)

進(jìn)腹后，首先游離左輸尿管及膀胱，結(jié)扎并切斷生殖靜脈和左腎上腺靜脈，完全游離左腎。左輸尿管保留少許膀胱壁（直徑約4 mm）切斷。結(jié)扎腸系膜上動(dòng)靜脈并切斷，向上游離主動(dòng)脈及腔靜脈至1.5 cm處。在腎血管以下0.3 cm處以3-0絲線穿過主動(dòng)脈及腔靜脈留置備用。頭皮針從上方穿刺入主動(dòng)脈，結(jié)扎備用線，切斷上方腔靜脈作為流出道，以4℃腎保存液及肝素鈉灌注左腎。待左腎顏色變蒼白一致時(shí)，取出左腎修整備用。

表1 腎移植24 h前各組中供的體預(yù)處理

1.4 受體腎移植

分別游離腎血管平面以下的腹主動(dòng)脈與腔靜脈，長度約2.0 cm，阻斷血流后，用9-0縫線將供腎所帶的主動(dòng)脈與受體腹主動(dòng)脈作端側(cè)吻合，此時(shí)通過尾靜脈補(bǔ)液8 mL。然后用8-0縫線將供腎所帶的腔靜脈與受體的腔靜脈作端側(cè)吻合。開放血管移植腎在10 s內(nèi)顏色迅速變紅。用8-0縫線將輸尿管吻合于受體膀胱上。切除受體雙腎。手術(shù)結(jié)束后，送入溫室內(nèi)飼養(yǎng)。

1.5 觀察指標(biāo)

腎移植后第3天處死大鼠，取血液標(biāo)本和移植腎標(biāo)本進(jìn)行檢測分析。

1.5.1 血清肌酐的檢測 將大鼠血漿標(biāo)本10 000 g離心20 min后取上層血清，使用自動(dòng)生化分析儀測定肌酐值。

1.5.2 移植腎組織中腫瘤壞死因子α（TNF-α）及熱休克蛋白70（HSP-70）水平的檢測 將移植腎標(biāo)本稱重，加入適量液氮，置于陶瓷研缽研磨成蛋白粉末后，移入勻漿器。按質(zhì)量體積比1∶5加入磷酸緩沖液及裂解液，4℃下3000r/min勻漿20次，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，離心30 min后，小心吸取上清液作為待測樣品。采用雙抗體夾心ELISA法測定上清液中TNF-α及HSP-70濃度。具體操作分別按照試劑盒提供的說明書進(jìn)行，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)2個(gè)復(fù)孔，酶標(biāo)儀450 nm處測定OD值。根據(jù)OD值和工作曲線計(jì)算樣本TNF-α及HSP-70的濃度。

1.5.3 移植腎組織病理學(xué)觀測 移植腎標(biāo)本制成厚4 μm切片，經(jīng)HE染色后，置于200倍光鏡下觀察，每張切片觀察20個(gè)不同的視野，腎組織病理學(xué)改變嚴(yán)重程度的判定標(biāo)準(zhǔn)為0～3分的評(píng)分。評(píng)分規(guī)則采用Jablonski損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[2]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鈣調(diào)磷酸酶抑制劑對(duì)供體預(yù)處理后大鼠血清肌酐的影響

與對(duì)照組相比，環(huán)孢素組[（115.12±25）μmol/L]及他克莫司組[（110.62±24）μmol/L]血清肌酐水平均明顯小于對(duì)照組[（186.25±21）μmol/L]，但高于單腎切除組[（48.25±6）μmol/L]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001），但環(huán)孢素組與他克莫司組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.719）。

2.2 移植腎組織中TNF-α的變化

腎移植術(shù)后第 3 天，環(huán)孢素組[（574.25±75）ng/L]及他克莫司組[（567.75±66）ng/L]移植腎組織中 TNF-α水平顯著低于對(duì)照組[（880.75±112）ng/L]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001 5）；但環(huán)孢素組與他克莫司組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.856）。

2.3 移植腎組織中HSP-70的變化

移植第 3 天，環(huán)孢素組[（217.62±23）ng/L]及他克莫司組[（219.75±37）ng/L]大鼠移植腎組織中 HSP-70 水平高于對(duì)照組[（181.88±26）ng/L]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.011）；但環(huán)孢素組與他克莫司組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.892）。

2.4 移植腎組織病理檢查

可見對(duì)照組腎小管細(xì)胞凋亡壞死，萎縮，腎小球腎小管結(jié)構(gòu)紊亂，見圖1。實(shí)驗(yàn)組（環(huán)孢素A組、他克莫司組）上述病理改變相對(duì)較輕。移植腎組織學(xué)評(píng)分結(jié)果：單腎切除組（0.23±0.14）分，對(duì)照組（2.35±0.23）分，環(huán)孢素 A 組（1.48±0.24）分，他克莫司組（1.59±0.22）分。

圖1 各組移植腎病理切片（HE染色，200倍）

3 討論

3.1 供體預(yù)處理減輕缺血再灌注損傷及意義

缺血性預(yù)處理[3]作為一種提高器官對(duì)缺血再灌注損傷的耐受性的有效手段，目前已在很多研究中得到證實(shí)，但在腎移植領(lǐng)域卻還未有應(yīng)用于臨床的報(bào)道，因?yàn)槿毖灶A(yù)處理是一種有創(chuàng)性的方法，實(shí)施過程中不可避免遇到倫理學(xué)方面的障礙以及安全性問題，此外，缺血性與處理相關(guān)研究尚未能給出最佳的預(yù)處理時(shí)間。筆者的實(shí)驗(yàn)采用了一種不同于缺血性預(yù)處理的方法，即藥物性預(yù)處理。相對(duì)于缺血性預(yù)處理，藥物性預(yù)處理具有無創(chuàng)，對(duì)機(jī)體損傷小的特點(diǎn)，方法簡單有效，特別是對(duì)活體供者具有廣泛的應(yīng)用前景。筆者的研究證實(shí)了在取腎術(shù)前24 h供體應(yīng)用CNIs預(yù)處理能夠有效提高對(duì)缺血的耐受性，這與Shihab等[4]的研究結(jié)果相一致。需要指出的是，Shihab等的研究在使用F334大鼠腎移植模型中觀察到供體術(shù)前24 h或7 d分別使用環(huán)孢素或他克莫司預(yù)處后，受體在術(shù)后第3天血清肌酐水平、菊粉清除率及移植腎組織學(xué)評(píng)分均有明顯改善。這說明該類藥物預(yù)處理至少有長達(dá)7 d的腎臟保護(hù)作用。由于筆者受到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)條件的限制，所以只研究了24 h前的預(yù)處理。研究顯示了供體應(yīng)用CNIs類藥物具有缺血狀態(tài)下的腎臟保護(hù)作用，這對(duì)臨床上活體腎移植具有很好的借鑒作用。在目前臨床上活體腎移植比例日益增多的背景下，具有十分重要的意義。

關(guān)于缺血再灌注損傷保護(hù)作用的研究，目前都是建立在非移植模型條件下，無法排除在腎移植過程中復(fù)雜的免疫環(huán)境及血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定狀態(tài)所帶來的干擾和偏倚。所以筆者選擇了在腎移植模型下術(shù)前對(duì)供體使用藥物進(jìn)行預(yù)處理，這更接近臨床腎移植過程。而使用Lewis近交系大鼠，最大限度降低了排斥反應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。我們之所以選擇供體作為預(yù)處理對(duì)象而不選擇受體是因?yàn)楣w預(yù)處理之后能夠在缺血保存期內(nèi)提供對(duì)腎臟的保護(hù)作用，而把受體作為預(yù)處理對(duì)象時(shí)顯然不能在供腎缺血保存期發(fā)揮作用。本研究在國內(nèi)首次利用大鼠腎移植模型研究了供體藥物性預(yù)處理對(duì)于接下來的腎移植過程中缺血再灌注的影響。對(duì)于如何減少腎移植過程中缺血再灌注損傷，提出了一種從供體角度入手的新思路。

3.2 供體應(yīng)用CNIs藥物預(yù)處理機(jī)制探討

目前對(duì)于CNIs供體預(yù)處理機(jī)制尚不十分清楚。現(xiàn)有的研究表明，炎癥反應(yīng)在缺血再灌注損傷中起非常重要的作用，再灌注過程中，許多炎癥因子如TNF-α、白細(xì)胞介素、趨化因子等釋放引起細(xì)胞損傷及凋亡。筆者的研究證實(shí)，在大鼠腎移植過程中，TNF-α的顯著升高是造成移植腎缺血再灌注損傷的重要原因。這可能是因?yàn)樵谌毖俟嘧⑦^程中鈣調(diào)磷酸酶（calcineurin，CN）因鈣超載而大量激活，活化后的CN可以使核因子-AT（NF-AT）去磷酸化而向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位，從而激活包括核因子-κB（NF-κB）在內(nèi)的一系列核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB是參與免疫與炎癥反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，在胞核內(nèi)參與調(diào)節(jié)多種基因轉(zhuǎn)錄，包括TNF-α、白介素2（IL-2）等參與炎癥反應(yīng)。新近的研究[5]還發(fā)現(xiàn)，CN激活后的NF-AT進(jìn)入胞核后，也可直接上調(diào)TNF-α的表達(dá)，所有上述依賴CN的過程都可以被CNIs抑制。筆者預(yù)先對(duì)供體使用CNIs后，觀察到環(huán)孢素A組以及他克莫司組移植腎組織內(nèi)TNF-α水平比生理鹽水對(duì)照組降低，說明在一定程度上CNIs預(yù)處理抑制了TNF-α的升高。這也與上述文獻(xiàn)結(jié)果相一致。此外，研究還發(fā)現(xiàn)該類藥物能夠抑制CN影響的NF-AT及p38 MAPK信號(hào)通路[6]，從而減少TNF-a的表達(dá)。因此，筆者認(rèn)為，在腎移植供體預(yù)處理時(shí)，使用CNIs能夠減少移植腎缺血再灌注時(shí)TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，從而減少缺血再灌注損傷的程度。

熱休克蛋白家族（HSP）在細(xì)胞缺氧及應(yīng)激狀態(tài)下的高表達(dá)，被認(rèn)為是細(xì)胞抗凋亡作用的重要機(jī)制。特別是HSP-70對(duì)氧化應(yīng)激、電離射線、TNF-α等引起的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與HSP抑制應(yīng)激激活蛋白激酶，抑制細(xì)胞凋亡基因p53和Bax的表達(dá)，抑制凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的蛋白水解酶和抑制氧自由基生成，以及對(duì)細(xì)胞線粒體功能的保護(hù)作用有關(guān)[7]。筆者的研究結(jié)果表明，CNIs預(yù)處理之后可以在移植腎組織內(nèi)觀察到HSP-70的表達(dá)水平增加。這可能使缺血再灌注發(fā)生時(shí)細(xì)胞保護(hù)作用得到加強(qiáng)。至于CNIs預(yù)處理引起HSP-70表達(dá)升高的機(jī)制目前還不十分清楚，尚待進(jìn)一步研究。

雖然實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TNF-α和HSP-70的表達(dá)變化是CNIs供體預(yù)處理減少腎移植缺血再灌注損傷的重要原因，但從目前的研究看來，參與缺血再灌注損傷的機(jī)制遠(yuǎn)非上述兩種，因?yàn)槿毖俟嘧⑦^程中各種損傷與抗損傷機(jī)制互相影響，其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜，諸多關(guān)鍵因子仍未完全確定。目前，HSP-70作為一種抗凋亡蛋白，其減少缺血再灌注損傷的作用受到較多關(guān)注，但遠(yuǎn)非唯一的保護(hù)機(jī)制。其他諸如HIFs積聚效應(yīng)[8]、血紅素加氧酶系統(tǒng)[9]、Fas及其配體、Caspases-1和Caspases-3等信號(hào)分子均有可能參與其中[10]。因此，鈣調(diào)磷酸酶抑制劑供體預(yù)處理顯示的腎臟保護(hù)作用，其詳細(xì)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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