供體應用鈣調磷酸酶抑制劑預處理減少大鼠腎移植缺血再灌注損傷及機制

唐 建 徐 達 王祥慧 周佩軍

上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院移植中心，上海 200025

缺血再灌注損傷在腎移植領域是無法避免的事件。這一事件使得移植物抗原暴露，增加了移植物免疫原性。對移植腎的影響一方面增加早期移植腎功能延遲恢復及排斥反應的發生率，另一方面也與移植腎長期預后相關[1]。因此，積極尋找某種策略來減少移植過程中缺血再灌注損傷的發生就顯得尤為重要。較缺血性預處理相比，藥物性預處理具有無創、對機體損傷小的優勢，其應用潛力巨大。因此，筆者設計本實驗，初步探討供體應用鈣調磷酸酶抑制劑（CNIs）類藥物預處理對腎移植缺血再灌注損傷的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

大鼠 TNF-a ELISA 試劑盒（R＆D systems，美國）；大鼠HSP-70 ELISA 試劑盒（R＆D systems，美國）；酶標儀（Labsystems Multiskan MS，芬蘭）；自動生化分析儀（Hitachi 7000，日本）；組織勻漿器（Pro Scientific，美國）；環孢素 A（Novartis Pharma GmbH，德國）；他克莫司（Astellas，日本）。

1.2 實驗動物及分組

雄性Lewis近交系大鼠，體重220～280 g，不限飲食。按供受體隨機分為3組：環孢素A組（CsA，10 mg/kg）、他克莫司組（Tac，1 mg/kg）、生理鹽水對照組，每組8對大鼠。另設單腎切除組（n=8）作為空白對照。腎移植24 h前各組中供體作如下預處理（表1）。

1.3 供體手術

進腹后，首先游離左輸尿管及膀胱，結扎并切斷生殖靜脈和左腎上腺靜脈，完全游離左腎。左輸尿管保留少許膀胱壁（直徑約4 mm）切斷。結扎腸系膜上動靜脈并切斷，向上游離主動脈及腔靜脈至1.5 cm處。在腎血管以下0.3 cm處以3-0絲線穿過主動脈及腔靜脈留置備用。頭皮針從上方穿刺入主動脈，結扎備用線，切斷上方腔靜脈作為流出道，以4℃腎保存液及肝素鈉灌注左腎。待左腎顏色變蒼白一致時，取出左腎修整備用。

表1 腎移植24 h前各組中供的體預處理

1.4 受體腎移植

分別游離腎血管平面以下的腹主動脈與腔靜脈，長度約2.0 cm，阻斷血流后，用9-0縫線將供腎所帶的主動脈與受體腹主動脈作端側吻合，此時通過尾靜脈補液8 mL。然后用8-0縫線將供腎所帶的腔靜脈與受體的腔靜脈作端側吻合。開放血管移植腎在10 s內顏色迅速變紅。用8-0縫線將輸尿管吻合于受體膀胱上。切除受體雙腎。手術結束后，送入溫室內飼養。

1.5 觀察指標

腎移植后第3天處死大鼠，取血液標本和移植腎標本進行檢測分析。

1.5.1 血清肌酐的檢測 將大鼠血漿標本10 000 g離心20 min后取上層血清，使用自動生化分析儀測定肌酐值。

1.5.2 移植腎組織中腫瘤壞死因子α（TNF-α）及熱休克蛋白70（HSP-70）水平的檢測 將移植腎標本稱重，加入適量液氮，置于陶瓷研缽研磨成蛋白粉末后，移入勻漿器。按質量體積比1∶5加入磷酸緩沖液及裂解液，4℃下3000r/min勻漿20次，轉移至離心管內，離心30 min后，小心吸取上清液作為待測樣品。采用雙抗體夾心ELISA法測定上清液中TNF-α及HSP-70濃度。具體操作分別按照試劑盒提供的說明書進行，每個樣本和標準品均設2個復孔，酶標儀450 nm處測定OD值。根據OD值和工作曲線計算樣本TNF-α及HSP-70的濃度。

1.5.3 移植腎組織病理學觀測 移植腎標本制成厚4 μm切片，經HE染色后，置于200倍光鏡下觀察，每張切片觀察20個不同的視野，腎組織病理學改變嚴重程度的判定標準為0～3分的評分。評分規則采用Jablonski損傷評分標準[2]。

1.6 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件處理數據，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鈣調磷酸酶抑制劑對供體預處理后大鼠血清肌酐的影響

與對照組相比，環孢素組[（115.12±25）μmol/L]及他克莫司組[（110.62±24）μmol/L]血清肌酐水平均明顯小于對照組[（186.25±21）μmol/L]，但高于單腎切除組[（48.25±6）μmol/L]，差異有統計學意義（P=0.001），但環孢素組與他克莫司組差異無統計學意義（P=0.719）。

2.2 移植腎組織中TNF-α的變化

腎移植術后第 3 天，環孢素組[（574.25±75）ng/L]及他克莫司組[（567.75±66）ng/L]移植腎組織中 TNF-α水平顯著低于對照組[（880.75±112）ng/L]，差異有統計學意義（P=0.001 5）；但環孢素組與他克莫司組相比差異無統計學意義（P=0.856）。

2.3 移植腎組織中HSP-70的變化

移植第 3 天，環孢素組[（217.62±23）ng/L]及他克莫司組[（219.75±37）ng/L]大鼠移植腎組織中 HSP-70 水平高于對照組[（181.88±26）ng/L]，差異具有統計學意義（P=0.011）；但環孢素組與他克莫司組相比差異無統計學意義（P=0.892）。

2.4 移植腎組織病理檢查

可見對照組腎小管細胞凋亡壞死，萎縮，腎小球腎小管結構紊亂，見圖1。實驗組（環孢素A組、他克莫司組）上述病理改變相對較輕。移植腎組織學評分結果：單腎切除組（0.23±0.14）分，對照組（2.35±0.23）分，環孢素 A 組（1.48±0.24）分，他克莫司組（1.59±0.22）分。

圖1 各組移植腎病理切片（HE染色，200倍）

3 討論

3.1 供體預處理減輕缺血再灌注損傷及意義

缺血性預處理[3]作為一種提高器官對缺血再灌注損傷的耐受性的有效手段，目前已在很多研究中得到證實，但在腎移植領域卻還未有應用于臨床的報道，因為缺血性預處理是一種有創性的方法，實施過程中不可避免遇到倫理學方面的障礙以及安全性問題，此外，缺血性與處理相關研究尚未能給出最佳的預處理時間。筆者的實驗采用了一種不同于缺血性預處理的方法，即藥物性預處理。相對于缺血性預處理，藥物性預處理具有無創，對機體損傷小的特點，方法簡單有效，特別是對活體供者具有廣泛的應用前景。筆者的研究證實了在取腎術前24 h供體應用CNIs預處理能夠有效提高對缺血的耐受性，這與Shihab等[4]的研究結果相一致。需要指出的是，Shihab等的研究在使用F334大鼠腎移植模型中觀察到供體術前24 h或7 d分別使用環孢素或他克莫司預處后，受體在術后第3天血清肌酐水平、菊粉清除率及移植腎組織學評分均有明顯改善。這說明該類藥物預處理至少有長達7 d的腎臟保護作用。由于筆者受到動物實驗條件的限制，所以只研究了24 h前的預處理。研究顯示了供體應用CNIs類藥物具有缺血狀態下的腎臟保護作用，這對臨床上活體腎移植具有很好的借鑒作用。在目前臨床上活體腎移植比例日益增多的背景下，具有十分重要的意義。

關于缺血再灌注損傷保護作用的研究，目前都是建立在非移植模型條件下，無法排除在腎移植過程中復雜的免疫環境及血流動力學不穩定狀態所帶來的干擾和偏倚。所以筆者選擇了在腎移植模型下術前對供體使用藥物進行預處理，這更接近臨床腎移植過程。而使用Lewis近交系大鼠，最大限度降低了排斥反應對實驗結果的干擾。我們之所以選擇供體作為預處理對象而不選擇受體是因為供體預處理之后能夠在缺血保存期內提供對腎臟的保護作用，而把受體作為預處理對象時顯然不能在供腎缺血保存期發揮作用。本研究在國內首次利用大鼠腎移植模型研究了供體藥物性預處理對于接下來的腎移植過程中缺血再灌注的影響。對于如何減少腎移植過程中缺血再灌注損傷，提出了一種從供體角度入手的新思路。

3.2 供體應用CNIs藥物預處理機制探討

目前對于CNIs供體預處理機制尚不十分清楚。現有的研究表明，炎癥反應在缺血再灌注損傷中起非常重要的作用，再灌注過程中，許多炎癥因子如TNF-α、白細胞介素、趨化因子等釋放引起細胞損傷及凋亡。筆者的研究證實，在大鼠腎移植過程中，TNF-α的顯著升高是造成移植腎缺血再灌注損傷的重要原因。這可能是因為在缺血再灌注過程中鈣調磷酸酶（calcineurin，CN）因鈣超載而大量激活，活化后的CN可以使核因子-AT（NF-AT）去磷酸化而向胞核內轉位，從而激活包括核因子-κB（NF-κB）在內的一系列核內轉錄因子，NF-κB是參與免疫與炎癥反應的重要轉錄因子，在胞核內參與調節多種基因轉錄，包括TNF-α、白介素2（IL-2）等參與炎癥反應。新近的研究[5]還發現，CN激活后的NF-AT進入胞核后，也可直接上調TNF-α的表達，所有上述依賴CN的過程都可以被CNIs抑制。筆者預先對供體使用CNIs后，觀察到環孢素A組以及他克莫司組移植腎組織內TNF-α水平比生理鹽水對照組降低，說明在一定程度上CNIs預處理抑制了TNF-α的升高。這也與上述文獻結果相一致。此外，研究還發現該類藥物能夠抑制CN影響的NF-AT及p38 MAPK信號通路[6]，從而減少TNF-a的表達。因此，筆者認為，在腎移植供體預處理時，使用CNIs能夠減少移植腎缺血再灌注時TNF-α等炎癥因子的表達，從而減少缺血再灌注損傷的程度。

熱休克蛋白家族（HSP）在細胞缺氧及應激狀態下的高表達，被認為是細胞抗凋亡作用的重要機制。特別是HSP-70對氧化應激、電離射線、TNF-α等引起的細胞凋亡具有保護作用，其作用機制與HSP抑制應激激活蛋白激酶，抑制細胞凋亡基因p53和Bax的表達，抑制凋亡信號轉導中的蛋白水解酶和抑制氧自由基生成，以及對細胞線粒體功能的保護作用有關[7]。筆者的研究結果表明，CNIs預處理之后可以在移植腎組織內觀察到HSP-70的表達水平增加。這可能使缺血再灌注發生時細胞保護作用得到加強。至于CNIs預處理引起HSP-70表達升高的機制目前還不十分清楚，尚待進一步研究。

雖然實驗結果顯示TNF-α和HSP-70的表達變化是CNIs供體預處理減少腎移植缺血再灌注損傷的重要原因，但從目前的研究看來，參與缺血再灌注損傷的機制遠非上述兩種，因為缺血再灌注過程中各種損傷與抗損傷機制互相影響，其調控網絡非常復雜，諸多關鍵因子仍未完全確定。目前，HSP-70作為一種抗凋亡蛋白，其減少缺血再灌注損傷的作用受到較多關注，但遠非唯一的保護機制。其他諸如HIFs積聚效應[8]、血紅素加氧酶系統[9]、Fas及其配體、Caspases-1和Caspases-3等信號分子均有可能參與其中[10]。因此，鈣調磷酸酶抑制劑供體預處理顯示的腎臟保護作用，其詳細機制仍需進一步研究。

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