牛病毒性腹瀉病毒抗原即時(shí)檢測(cè)試劑盒的性能評(píng)價(jià)

羅海峰 葛艷華 Gu Hao-yi Anton Mestek Jr. 翁立楠 Christian Schelp Christoph Egli Serge Leterme

1.北京愛(ài)德士元亨生物科技有限公司，北京 101300；2.IDEXX Laboratories Inc.，Westbrook-Maine 04092；3.IDEXX Switzerland AG，Liebefeld-Bern 3097

牛病毒性腹瀉-黏膜病（bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD）是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的主要發(fā)生于牛的一種急性、熱性傳染病，在臨床上引起一系列復(fù)雜的癥狀，主要包括牛的病毒性腹瀉、急慢性黏膜病、免疫耐受和持續(xù)性感染、免疫抑制、繁殖障礙、血小板減少和出血癥等，致病機(jī)理非常復(fù)雜[1-3]，嚴(yán)重影響?zhàn)B牛業(yè)生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)。同時(shí)，牛病毒性腹瀉病毒是一種世界范圍廣泛分布的危害動(dòng)物健康的重要病原體，它不僅感染牛，而且能夠感染豬、綿羊、山羊、鹿、駱駝及其它野生動(dòng)物[1,3]。

妊娠母牛感染非致細(xì)胞病理變化型BVDV后，此時(shí)胎兒的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，不能識(shí)別外來(lái)的BVDV，初生犢牛一旦成活，其臨診癥狀表現(xiàn)正常，血清學(xué)反應(yīng)呈陰性，而此時(shí)犢牛則處于免疫耐受狀態(tài)，成為持續(xù)感染（Persistently infected，PI）者，持久帶毒、排毒，PI牛也就成為了BVDV在牛群中流行的傳染源[1-5]。有些PI牛會(huì)表現(xiàn)出黏膜病的癥狀（腹瀉、發(fā)育不良、久配不孕等），但是有些PI牛不表現(xiàn)任何癥狀，從而被當(dāng)作正常牛只一直在牛群飼養(yǎng)[6]，并使BVDV在牛群中傳播。可見(jiàn)對(duì)于BVDV持續(xù)感染牛的檢測(cè)將有利于牛群生長(zhǎng)發(fā)育。本文對(duì)于新近開(kāi)發(fā)的牛病毒性腹瀉病毒抗原即時(shí)檢測(cè)（BVDV Ag POC）試劑盒的性能進(jìn)行了評(píng)價(jià)，通過(guò)與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）進(jìn)行比較探索其用于檢測(cè)BVDV持續(xù)感染牛的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

Erns（gp48）蛋白由IDEXX Switzerland AG瑞士研發(fā)中心提供；不同亞型BVDV抗原陽(yáng)性血清樣本由IDEXX Laboratories Inc.美國(guó)研發(fā)中心提供；BVDV Ag ELISA試劑盒及BVDV Ag POC試劑盒均來(lái)自于IDEXX Laboratories Inc.；全血樣本、血漿樣本以及小耳組織樣本來(lái)自于牛場(chǎng)。

1.2 方法

1）BVDV Ag ELISA檢測(cè)血清血漿的操作方法。血清血漿樣本直接加入到ELISA板內(nèi)，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行孵育和后續(xù)操作。設(shè)2孔陰性對(duì)照和2孔陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照平均值減去陰性對(duì)照平均值，其差必須大于或等于0.150；通過(guò)計(jì)算每個(gè)樣品與陰性對(duì)照平均值的差值（S-N）來(lái)判定BVDV抗原結(jié)果。如果S-N值小于或等于0.300，判為BVDV抗原陰性；如果S-N值大于0.300，判為BVDV抗原陽(yáng)性。

2）BVDV Ag ELISA檢測(cè)小耳組織樣本的操作方法。對(duì)于小耳組織樣本首先采用耳組織浸泡液在室溫下浸泡12～24h后，混勻，取樣加入ELISA板內(nèi)，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行孵育和后續(xù)操作。設(shè)2孔陰性對(duì)照和2孔陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照平均值減去陰性對(duì)照平均值，其差必須大于或等于0.150；通過(guò)計(jì)算每個(gè)樣品與陰性對(duì)照平均值的差值（S-N）來(lái)判定BVDV抗原結(jié)果。如果S-N值小于或等于0.200，判為BVDV抗原陰性；如果S-N值小于或等于0.300但大于0.200，判為可疑；如果S-N值大于0.300，判為BVDV抗原陽(yáng)性。

3）BVDV持續(xù)感染牛的判定。對(duì)于第1次采樣檢測(cè)BVDV抗原陽(yáng)性的牛只，在7～14d后再次進(jìn)行采樣，并使用BVDV Ag ELISA進(jìn)行檢測(cè)。如果再次檢測(cè)為BVDV抗原陽(yáng)性，則該動(dòng)物為BVDV持續(xù)感染牛；如果再次檢測(cè)結(jié)果為BVDV抗原陰性，則該動(dòng)物不是BVDV持續(xù)感染牛。

4）BVDV Ag POC檢測(cè)全血、血清和血漿的操作方法。將檢測(cè)裝置放在平整的桌面上，使用提供的滴管滴將1滴樣本滴入檢測(cè)裝置的加樣孔中，1min內(nèi)滴加2滴緩沖液并且開(kāi)始計(jì)時(shí)，15min后觀察結(jié)果；質(zhì)控線位置呈現(xiàn)紅色條帶顯示試驗(yàn)有效；檢測(cè)線的顏色強(qiáng)于背景結(jié)果，判為陽(yáng)性；檢測(cè)線的顏色與背景顏色相同或弱于背景顏色，結(jié)果為陰性。

5）BVDV Ag POC檢測(cè)耳組織樣本的操作方法。耳組織樣本裝入樣品管中，然后滴加8滴（對(duì)于小耳組織樣本）或者16滴（對(duì)于大耳組織樣本）緩沖液，浸泡5min以上，徹底混勻后使用提供的滴管滴將1滴樣本滴入檢測(cè)裝置的加樣孔中，1min內(nèi)滴加2滴緩沖液并且開(kāi)始計(jì)時(shí)，15min后觀察結(jié)果。質(zhì)控線位置呈現(xiàn)紅色條帶顯示試驗(yàn)有效；檢測(cè)線的顏色強(qiáng)于背景顏色，判為陽(yáng)性；檢測(cè)線的顏色與背景顏色相同或弱于背景，結(jié)果為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)于Erns蛋白的檢測(cè)及稀釋靈敏度比較

對(duì)于采用基因工程表達(dá)的Erns蛋白進(jìn)行系列稀釋?zhuān)⑶也捎肂VDV Ag ELISA和BVDV Ag POC分別進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，BVDV Ag POC可以有效檢測(cè)Erns，并且對(duì)于Erns的稀釋靈敏度與ELISA相同。

2.2 對(duì)于BVDV 1型和2型血清的檢測(cè)

使用BVDV Ag POC檢測(cè)21份已知病毒亞型的BVDV Ag陽(yáng)性血清，其中包含有13份BVDV 1型血清和8份BVDV 2型血清，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，BVDV Ag POC可以有效檢測(cè)BVDV 1型和2型病毒。

2.3 對(duì)于全血樣本的檢測(cè)

自9個(gè)牛場(chǎng)收集824份全血樣本，采用BVDV Ag POC進(jìn)行檢測(cè)，記錄結(jié)果。采用BVDV Ag ELISA對(duì)于全血樣本分離得到的血漿進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果的牛只1周以后再次采血進(jìn)行檢測(cè)，如果再次為陽(yáng)性，則判定為持續(xù)感染（PI），并且記錄相應(yīng)結(jié)果。將BVDV Ag POC檢測(cè)結(jié)果與BVDV Ag ELISA檢測(cè)的PI結(jié)果相比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表1 Erns蛋白系列稀釋的檢測(cè)結(jié)果

表2 對(duì)21份已知BVDV亞型血清樣本的檢測(cè)

由表3可見(jiàn)，與BVDV Ag ELISA相比，BVDV Ag POC對(duì)于全血樣本檢測(cè)的靈敏度是100.0%，特異性為99.1%。

2.4 對(duì)于血漿樣本的檢測(cè)

自9個(gè)牛場(chǎng)收集587份血漿樣本，采用BVDV Ag POC進(jìn)行檢測(cè)，記錄結(jié)果；同時(shí)采用BVDV Ag ELISA進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果的牛只1周以后再次采血進(jìn)行檢測(cè)，如果再次為陽(yáng)性，則判定為持續(xù)感染，并且記錄相應(yīng)結(jié)果。將BVDV Ag POC檢測(cè)結(jié)果與BVDV Ag ELISA檢測(cè)的PI結(jié)果相比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可見(jiàn)，與BVDV Ag ELISA相比，BVDV Ag POC對(duì)于血漿樣本檢測(cè)的靈敏度是100.0%，特異性為99.4%。

表3 BVDV Ag POC檢測(cè)全血樣本

表4 BVDV Ag POC檢測(cè)血漿樣本

表5 BVDV Ag POC檢測(cè)小耳組織樣本

2.5 對(duì)于耳組織樣本的檢測(cè)

自4個(gè)牛場(chǎng)收集400份小耳組織樣本，采用BVDV Ag POC進(jìn)行檢測(cè)，記錄結(jié)果；同時(shí)進(jìn)行BVDV Ag ELISA檢測(cè)，對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果的牛只1周以后再次采樣檢測(cè)，如果再次為陽(yáng)性，則判定為持續(xù)感染，并且記錄相應(yīng)結(jié)果。將BVDV Ag POC檢測(cè)結(jié)果與BVDV Ag ELISA檢測(cè)的PI結(jié)果相比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可見(jiàn)，與BVDV Ag ELISA相比，BVDV Ag POC對(duì)于全血樣本檢測(cè)的靈敏度是100%，特異性為100%。

3 討論

目前OIE推薦的BVDV抗原檢測(cè)方法，也是國(guó)際貿(mào)易標(biāo)準(zhǔn)方法，包括病毒分離（Virus Isolation）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫組化（Immunohistochemistry）以及核酸檢測(cè)（Nucleic acid detection）[2]。目前ELISA方法作為檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒的經(jīng)典方法，已經(jīng)被應(yīng)用于多個(gè)國(guó)家的凈化計(jì)劃中，其特異性強(qiáng)、靈敏度和可靠性都很高[4,7-8]。但是由于目前OIE推薦的4種方法均需要一定的實(shí)驗(yàn)條件，并且試驗(yàn)結(jié)果需要經(jīng)過(guò)幾小時(shí)到幾天的時(shí)間才可獲得。因此開(kāi)發(fā)一種靈敏度、特異性與ELISA方法相似，同時(shí)操作簡(jiǎn)便、不需要特殊儀器的檢測(cè)方法，對(duì)于小型農(nóng)場(chǎng)的疾病防控，以及在需要盡快獲得檢測(cè)結(jié)果的場(chǎng)合下使用，具有重大的優(yōu)勢(shì)。牛病毒性腹瀉病毒抗原即時(shí)檢測(cè)試劑盒采用膠體金技術(shù)，運(yùn)用側(cè)向?qū)游鲈恚梢栽诩尤霕颖竞?5min獲得結(jié)果，所有反應(yīng)在室溫下即可完成，不需要任何其他儀器及特殊的實(shí)驗(yàn)條件，完全達(dá)到快速檢測(cè)的要求，可以滿足各種環(huán)境下對(duì)于單一樣本快速檢測(cè)的需求。

PI牛的清除是牛場(chǎng)清除BVDV的重要目標(biāo)，運(yùn)用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)手段檢出這些PI牛，一定要在第一時(shí)間將它們隔離出群，并盡早淘汰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BVDV Ag POC檢測(cè)標(biāo)的物為 Erns，Erns蛋白為檢測(cè)BVDV的重要靶蛋白[5,9]，該試劑盒可以準(zhǔn)確有效地檢測(cè)出樣本中BVDV的存在；對(duì)于1型和2型BVDV均可以檢測(cè)。對(duì)于824份全血樣本、587份血漿樣本以及400份小耳組織樣本的檢測(cè)顯示，所有的PI牛全被BVDV Ag POC檢測(cè)出，靈敏度達(dá)到100%，針對(duì)不同類(lèi)型的樣品，BVDV Ag POC特異性略有不同，但都超過(guò)99%。該結(jié)果顯示BVDV Ag POC與ELISA方法具有極高的符合性，其性能可以滿足對(duì)于BVDV PI牛檢測(cè)的需求。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)北京地區(qū)7個(gè)規(guī)模化奶牛場(chǎng)共14028頭荷斯坦奶牛進(jìn)行BVDV抗原檢測(cè).共檢出PI牛58頭，其中成母牛9頭，后備牛49頭；場(chǎng)內(nèi)陽(yáng)性率0.04～1.02%[6]。從河北省部分牛場(chǎng)采集1030份樣本進(jìn)行BVDV抗原檢測(cè)，平均檢出率40.9%[10]。可見(jiàn)，BVDV廣泛存在于國(guó)內(nèi)的牛場(chǎng)中。參照瑞典凈化BVDV的經(jīng)驗(yàn)，明確牛只感染狀況，及時(shí)清除PI牛，同時(shí)控制引入的牛只，將有助于病毒的凈化。而B(niǎo)VDV Ag POC作為可以單一檢測(cè)的快速檢測(cè)試劑盒，可用于及時(shí)明確新生犢牛、引入牛只的BVDV感染狀況。同時(shí)歐洲的清除計(jì)劃也顯示出快速確定牛只感染狀況，也有利于清除病毒[1,4,7-8]。由此，牛病毒性腹瀉病毒抗原即時(shí)檢測(cè)試劑盒作為一個(gè)可以快速檢測(cè)樣品中BVDV抗原的試劑，可以成為牛場(chǎng)進(jìn)行BVDV的防控及清除的有力工具。

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