牛病毒性腹瀉-黏膜病的流行病學(xué)調(diào)查

鄧明亮 費(fèi)文濤 紀(jì)素坤 張 瑞 陳穎鈺 郭愛珍 *

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，武漢 430070；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，武漢 430070

牛病毒性腹瀉（BVD）又稱牛病毒性腹瀉-黏膜病，是由牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）引起的一種病理過程復(fù)雜、臨床表現(xiàn)多樣的傳染病。病牛臨床表現(xiàn)為腹瀉，急、慢性黏膜病，持續(xù)性感染與免疫耐受，母畜流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和畸形胎等[1]。本病世界廣泛流行，1980年李佑民首次從流產(chǎn)胎兒脾臟中分離到BVDV，證實了我國也存在本病。其后在全國20多個省、市都相繼發(fā)現(xiàn)了該病的存在[2-4]。該病較少表現(xiàn)特征性臨床癥狀，且多伴有持續(xù)感染和免疫耐受等隱性感染，加之缺乏安全有效的BVD疫苗，給該病的防控帶來了很多困難，導(dǎo)致我國牛群BVDV感染日趨嚴(yán)重[5]。BVDV除感染肉牛、奶牛、水牛和牦牛外，還可感染羊、豬、鹿等多種家養(yǎng)和野生動物[6-7]。楊得勝等[8]對福建省9個地區(qū)2006-2008年的15個大型牛場和56個散養(yǎng)戶牛進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，品種包括奶牛、肉牛和水牛，平均陽性率達(dá)93.1%。菅復(fù)春等[9]對河南省的6個奶牛場、5個肉牛養(yǎng)殖場的181份牛奶樣品和395份血清樣品進(jìn)行BVD抗體的檢測，牛奶樣品平均陽性率為58.6%，肉牛血清樣品平均陽性率為31.39%。高雙娣等[10]利用細(xì)胞中和試驗對陜西、甘肅、寧夏、青海和四川5省（區(qū)）部分地區(qū)的黃牛群和牦牛群進(jìn)行BVDV調(diào)查，結(jié)果黃牛群BVD陽性檢出率為46.15%，牦牛群BVD陽性檢出率為30.08%。

BVD可嚴(yán)重影響牛的繁殖和生產(chǎn)，給養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失；而我國的規(guī)模化養(yǎng)牛場主要集中在北方地區(qū)，為了解北方地區(qū)牛群中該病感染情況，我們對采自北方地區(qū)2個大型屠宰場（屠宰的肉牛主要來源于東北各地養(yǎng)殖場）和青海地區(qū)的牦牛血清進(jìn)行了本病的流行病學(xué)調(diào)查，以便為今后對該病的凈化與防控工作提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

牛病毒性腹瀉抗體檢測試劑盒和牛病毒性腹瀉抗原檢測試劑盒，均購自IDEXX。收集內(nèi)蒙古通遼市大型屠宰場肉牛血清276份，遼寧大連市大型屠宰場肉牛血清164份。屠宰場的肉牛均來自北方各地養(yǎng)殖場。牦牛血清：采自青海省祁連縣、天駿縣、湟源縣、海晏縣和門源縣5個縣共400份。

1.2 方法

1）牛病毒性腹瀉抗原檢測試劑盒操作方法：若于冰箱中保存，應(yīng)使所有組件于18～30℃下平衡30min；將SNAPBVD檢測器放置于平整的表面上，在整個檢測過程中，均必須將SNAPBVD檢測器保持在水平位置，以確保結(jié)果精準(zhǔn)；將150μL樣品加入干凈的樣品管內(nèi)；將200μL結(jié)合物加入樣品管內(nèi)；將樣品管蓋上，并上下顛倒3～5次以充分混勻。將含有結(jié)合物混合液的加蓋樣品管放入45℃的培養(yǎng)箱中，至少培養(yǎng)10min；將樣品管中的內(nèi)容物注入樣品孔中；15～60s后，樣品會流過結(jié)果窗并達(dá)到啟動環(huán)；在啟動環(huán)中呈色時，穩(wěn)固按下啟動器，直到啟動器與SNAP檢測器的本體齊平為止，用力按下；10min后判讀檢測結(jié)果。

2）牛病毒性腹瀉抗體檢測試劑盒操作方法：所有試劑在使用前一律恢復(fù)至室溫（18～25℃），輕輕搖動或旋轉(zhuǎn)，使試劑混合均勻。用移液器在酶標(biāo)板每孔中加入100μL樣品稀釋液，在相應(yīng)的陰性和陽性對照孔中加入25μL對照血清，平行做2孔，其他各孔均加入25μL檢測血樣；輕彈酶標(biāo)板或用振蕩器振蕩，將酶標(biāo)板中的溶液充分混勻；在室溫（18～25℃）孵育90min，然后將反應(yīng)孔中的溶液吸出。在每個反應(yīng)孔中加入約300μL洗滌液進(jìn)行洗滌，洗滌5次；每次洗滌后吸出所有孔中的液體，在最后1次洗滌完成后，將酶標(biāo)板在吸水紙上拍干；再在每個反應(yīng)孔中加入100μL酶標(biāo)抗體，室溫下（18～25℃）孵育30min；再洗滌5次，在每個反應(yīng)孔中加入100μLTMB底物，室溫下避光孵育10min后，每個反應(yīng)孔中加入100μL終止液終止反應(yīng)；將酶標(biāo)儀在空氣中調(diào)零，用450nm波長測定和記錄樣品以及對照的吸光值。

3）檢測判讀。抗原檢測判讀：陽性結(jié)果（PI狀態(tài)）——若樣品點(diǎn)中所呈現(xiàn)的藍(lán)色比背景深時，則該樣品被判為陽性。陰性結(jié)果（Non-PI（非持續(xù)感染）狀態(tài)）——若樣品點(diǎn)中的藍(lán)色與背景相同或比背景淺時，則該樣品被判為陰性。

抗體檢測判讀：陽性對照的平均值（PCX）與陰性對照的平均值（NCX）之間，P-N的差必須大于或等于0.150的吸光（OD）值；另外，陰性對照平均值（NCX）必須小于或等于0.250的OD值，表明檢測結(jié)果有效。計算待檢血清的（樣品OD值-陰性O(shè)D值）/（陽性O(shè)D值-陰性O(shè)D值）（S/P值），若S/P值＜0.200，則判為BVDV抗體陰性；S/P值＞0.300，則判為BVDV抗體陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原檢測結(jié)果

對采自內(nèi)蒙古通遼市、遼寧大連市的2個大型屠宰場共440份肉牛血清和青海省5個縣的400份牦牛血清進(jìn)行了BVD血清學(xué)抗原檢測，結(jié)果顯示3個地區(qū)均檢出抗原陽性血清，共檢出抗原陽性血清6份，平均陽性率為0.71%，最高陽性率達(dá)1.96%，見表1。

BVD血清學(xué)抗原檢測結(jié)果顯示不同品種感染情況也不同，肉牛、牦牛血清抗原陽性數(shù)均為3份，但陽性率分別為0.68%、0.75%，見表2。

2.2 抗體檢測結(jié)果

隨機(jī)抽取668份血清（肉牛血清392份、牦牛血清276份）進(jìn)行BVD血清學(xué)抗體檢測，包括以上抗原檢測為陽性的6份血清，結(jié)果顯示共檢出陽性血清392份，平均陽性率58.68%，最高陽性率達(dá)84.48%，最低陽性率20%，見表3；并且血清學(xué)抗原陽性的6份血清抗體檢測均為陰性，表明肉牛、牦牛群均存在PI牛，PI牛檢出率分別為 0.77%、1.09%，見表 4。

不同品種的血清學(xué)抗體陽性率也不同，肉牛、牦牛血清抗體陽性數(shù)分別為248、144份，陽性率分別為63.27%、52.17%，見表5。

表1 不同地區(qū)BVD血清學(xué)抗原檢測結(jié)果

表2 不同品種BVD血清學(xué)抗原檢測結(jié)果

表3 不同地區(qū)BVD血清學(xué)抗體檢測結(jié)果

表4 PI牛檢測結(jié)果

表5 不同品種BVD血清學(xué)抗體檢測結(jié)果

3 討 論

近年來，我國養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展迅速，但隨著養(yǎng)牛規(guī)模的不斷擴(kuò)大，BVD也呈迅猛傳播之勢，對養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大損失，給整個畜牧業(yè)發(fā)展帶來了嚴(yán)重影響。雪梅等[11]于2002-2006年對四川阿壩牧區(qū)的牦牛進(jìn)行了調(diào)查和統(tǒng)計，阿壩、紅原和若爾蓋3個縣部分地區(qū)共發(fā)病1983頭，死亡362頭，死亡率為18.26%；通過BVD瓊脂擴(kuò)散試驗和BVD血清中和試驗進(jìn)行血清學(xué)檢查，陽性率分別為25.0%和42.3%。薛艱省等[12]對青海省高寒牧區(qū)牦牛進(jìn)行了感染情況調(diào)查，對來自瑪沁縣的87份血清樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果在87份血清樣品中檢出陽性10份，占11.49%；流行病學(xué)調(diào)查久治縣存欄牛7715頭，發(fā)病1750頭，死亡225頭，發(fā)病率和死亡率分別為22.68%和2.92%。邱昌慶等[13]對山東、河南和河北省的6個規(guī)模化肉牛場進(jìn)行抗體、抗原檢測，證實我國中原地區(qū)肉牛群中BVD感染嚴(yán)重。

本次對內(nèi)蒙古、遼寧肉牛和青海牦牛群進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示3個地區(qū)均檢出抗原陽性血清，共檢出抗原陽性血清6份，平均陽性率為0.71%，最高陽性率為1.96%。血清學(xué)抗體平均陽性率為58.68%，最高陽性率達(dá)84.48%，最低陽性率20.00%。表明BVD在我國北方牛群中普遍存在，而且感染率和感染范圍日趨嚴(yán)重。分析其主要原因可能是集約化規(guī)模養(yǎng)殖的發(fā)展提高了牛只間傳染的概率；近年來北方地區(qū)極端天氣的多發(fā)引起機(jī)體抵抗力下降；該病特征性臨床癥狀較少，在實際生產(chǎn)中易被忽視；牛群缺乏系統(tǒng)的監(jiān)測防控措施等。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，檢出的6份抗原陽性血清其對應(yīng)血清抗體檢測均為陰性，表明牛群中存在PI牛，肉牛、牦牛PI牛檢出率分別為0.77%、1.09%，與國外報道的PI牛檢出率（0.5%～2.0%）基本相符[14]。而肉牛、牦牛群抗體陽性率分別為63.27%、52.17%，這說明血清抗體陽性率與PI牛檢出率二者之間沒有線性關(guān)系，與張俊杰等[15]調(diào)查的結(jié)果一致。雖然PI牛的存活時間一般不超2a，但終生帶毒并通過鼻液、唾液、尿液、眼淚和乳汁等分泌物向體外排毒，成為該病的危險傳染源，在規(guī)模化養(yǎng)殖場中隨著牛只的頻繁轉(zhuǎn)群變動1頭PI牛就可以在其1a左右的生存期內(nèi)使整個牛群感染BVDV。因此必須制定有效的BVD清除計劃，加強(qiáng)PI牛的檢測，全群篩查并淘汰PI牛，逐步達(dá)到凈化牛群的目的。

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