絮凝菌MBF03發(fā)酵條件的優(yōu)化

陳 俊，王 濤，陳 哲，武文麗，詹志鋼

(武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430081)

微生物絮凝劑(MBF)是利用微生物技術(shù)，通過發(fā)酵、提取、精制而得到的一類新型、高效、可降解的水處理劑[1]。MBF的分子量一般大于1×105，其主要成分包括糖蛋白、多糖、蛋白質(zhì)、纖維素等[2]。雖然MBF有著傳統(tǒng)無機(jī)和有機(jī)絮凝劑無可比擬的優(yōu)勢(shì)，但是由于產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高，制約了其工業(yè)化應(yīng)用，目前仍處于實(shí)驗(yàn)室階段。因此，優(yōu)化MBF產(chǎn)生菌的發(fā)酵條件、提高生物絮凝劑產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本十分重要。為此，作者以高效絮凝菌MBF03為材料，探討了碳源、氮源、初始pH值、培養(yǎng)時(shí)間、接種量和金屬離子對(duì)絮凝劑產(chǎn)生及絮凝效果的影響，并對(duì)其絮凝活性分布進(jìn)行了分析，擬為絮凝菌MBF03的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種與培養(yǎng)基

絮凝菌MBF03，自行選育[3]并保藏。

GC培養(yǎng)基(g·L-1)[4]：葡萄糖12.0，酵母膏1.0，K2HPO41.0，KH2PO40.5，尿素0.5，NaCl 0.2，MgSO40.2，pH值6.5～7.3，115 ℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.2.1.1 最適碳源的確定[5]

分別以等量的可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖、半乳糖、D-果糖代替GC培養(yǎng)基中的葡萄糖，30 ℃培養(yǎng)48 h后，測(cè)絮凝率。

1.2.1.2 最適氮源的確定[6]

分別以等量的硝酸鈉、硝酸鉀、蛋白胨、尿素、硝酸銨代替GC培養(yǎng)基中的酵母膏，30 ℃培養(yǎng)48 h后，測(cè)絮凝率。

1.2.1.3 最適初始pH值的確定[7]

調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值分別為3、4、5、6、7、8、9，30 ℃培養(yǎng)48 h后，測(cè)絮凝率。

1.2.1.4 最適培養(yǎng)時(shí)間的確定

分別培養(yǎng)6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h、54 h、60 h、66 h、72 h、78 h，測(cè)定pH值、絮凝率和細(xì)胞干重。

1.2.1.5 最適接種量的確定[8]

接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%，30 ℃培養(yǎng)48 h后，測(cè)絮凝率。

1.2.1.6 金屬離子對(duì)絮凝效果的影響[9]

測(cè)定不同投加量的Ca2+和Mg2+對(duì)絮凝率的影響。

1.2.2 絮凝活性分布測(cè)定[10]

取10 mL發(fā)酵液于12 000 r·min-1離心20 min，收集上清液，并定容至10 mL，備用。分別測(cè)定發(fā)酵液、上清液和離心沉淀的絮凝率。

1.2.3 分析檢測(cè)

絮凝率可采用高嶺土法[8]和鋁土礦粉法(用200目的鋁土礦粉代替高嶺土，其它步驟同高嶺土法)測(cè)定；細(xì)胞干重分析參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳源對(duì)絮凝效果的影響(圖1)

圖1 碳源對(duì)絮凝率的影響

由圖1可以看出，以葡萄糖作為碳源，絮凝菌MBF03的絮凝率最高。這是因?yàn)椋跄鶰BF03良好的絮凝活性主要是由其豐富的胞外多糖(經(jīng)鑒定為胞外酸性多糖[3])賦予的，而以葡萄糖作為碳源有利于胞外多糖的合成[11]。因此，選擇最適碳源為葡萄糖。

2.2 氮源對(duì)絮凝效果的影響(圖2)

圖2 氮源對(duì)絮凝率的影響

由圖2可以看出，以無機(jī)氮源硝酸銨作為氮源，絮凝菌MBF03的絮凝率最高；而酵母膏等有機(jī)氮源雖營養(yǎng)豐富，但與無機(jī)氮源相比，微生物利用速度緩慢[12]，絮凝效果不是很好。因此，選擇最適氮源為硝酸銨。

2.3 初始pH值對(duì)絮凝效果的影響(圖3)

圖3 初始pH值對(duì)絮凝率的影響

由圖3可以看出，初始pH值為6時(shí)，絮凝菌MBF03的絮凝率最高。因此，選擇最適初始pH值為6。

2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體生長和絮凝效果的影響(圖4)

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌體生長和絮凝效果的影響

由圖4可以看出，絮凝菌MBF03的絮凝率在培養(yǎng)18 h時(shí)就達(dá)到85.91%，培養(yǎng)48 h時(shí)達(dá)到最高，為90%，之后緩慢下降，在78 h時(shí)仍有80.97%；細(xì)胞干重在培養(yǎng)24 h左右達(dá)到最大值，之后逐漸降低；菌液pH值在培養(yǎng)初期略有下降，但12 h后基本穩(wěn)定在6左右。綜合來看：細(xì)胞生長量在24 h時(shí)達(dá)到峰值，而絮凝率的峰值出現(xiàn)在48 h，表明并不是細(xì)胞量最多的時(shí)候絮凝率最高。這是因?yàn)?，絮凝活性主要來自于胞外分泌物，從?xì)胞量達(dá)到最多到胞外分泌物達(dá)到最多需要一定的時(shí)間，即有一個(gè)代謝延遲。由圖4還可以看出，培養(yǎng)48～72 h，絮凝菌MBF03的絮凝率沒有明顯的下降，這說明MBF03菌所產(chǎn)的絮凝劑穩(wěn)定性良好。

2.5 接種量對(duì)絮凝效果的影響(圖5)

圖5 接種量對(duì)絮凝率的影響

由圖5可以看出，接種量過多或過少都會(huì)降低絮凝率，在接種量為4%時(shí)絮凝率達(dá)到最高。這是因?yàn)椋臃N量過多，發(fā)酵液中的菌很快達(dá)到生長平臺(tái)期，細(xì)胞干重達(dá)到最大值，而細(xì)胞干重最大值與絮凝活性最大值(即胞外酸性多糖的最大值)之間存在時(shí)間延遲，所以如果很快達(dá)到生長平臺(tái)期，是不利于胞外酸性多糖的分泌與累積的，從而導(dǎo)致絮凝率較低；而接種量過少，細(xì)胞達(dá)到生長平臺(tái)期時(shí)間過長，導(dǎo)致反應(yīng)體系中增殖代數(shù)過多的菌的老化，也不利于胞外酸性多糖的代謝與分泌，也會(huì)導(dǎo)致絮凝率較低。因此，選擇最適接種量為4%。

2.6 金屬離子對(duì)絮凝效果的影響

在100 mL懸濁液中分別投加不同量的1 g·L-1Mg2+溶液和Ca2+溶液，探討金屬離子對(duì)絮凝效果的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 金屬離子對(duì)絮凝率的影響

由圖6可以看出，隨著Ca2+、Mg2+投加量的增大，絮凝率先升高后降低。這是因?yàn)?，適量的金屬離子中和了顆粒物基團(tuán)表面的負(fù)電荷，使不同顆粒容易聚合，從而加強(qiáng)了絮凝劑的絮凝效果；而過多金屬陽離子的引入導(dǎo)致電荷相斥，不利于絮凝劑之間的橋連[13]，反而導(dǎo)致絮凝率降低。比較Ca2+、Mg2+對(duì)絮凝效果的影響，可以看出Ca2+更適合作絮凝菌BMF03的助凝劑，最適投加量為2.0%。

2.7 絮凝活性的分布(圖7)

圖7 絮凝活性分布

由圖7可知，發(fā)酵液的絮凝率為90.2%，上清液的絮凝率為85.6%，離心沉淀的絮凝率僅為36%，空白培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，其絮凝率接近零。說明MBF03的絮凝活性成分主要分布在發(fā)酵上清液中。對(duì)于絮凝菌MBF03，其絮凝活性成分是胞外分泌物，這些分泌物大部分?jǐn)U散到上清液中，使得上清液具有較高的絮凝活性[12]；菌體表面附著的少量胞外分泌物以及菌體本身的細(xì)胞外被(多糖類物質(zhì)或者糖蛋白)[14]使得離心沉淀也有較低的絮凝活性。

3 結(jié)論

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，絮凝菌MBF03的最適碳源和氮源分別為葡萄糖和硝酸銨、最適pH值為6、最適接種量為4%；菌體生長與活性物質(zhì)的分泌與累積存在24 h的時(shí)間延遲；Ca2+的助凝效果優(yōu)于Mg2+；絮凝活性成分主要分布在發(fā)酵上清液中。

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