鹽酸戊乙奎醚對失血性休克大鼠腸黏膜的保護作用

蔣志平 夏中元 張 蕾 孟慶濤 李文瀾 吳 迪 賈一帆 侯家保

1.武漢大學人民醫院麻醉科，湖北 武漢 430061；2.湖北省隨州市婦幼保健院麻醉科，湖北 隨州 441300

失血性休克是臨床常見現象，其主要的病理生理是所有的組織器官得不到足夠的血液和氧氣來維持基本的代謝活動，隨后的再灌注常使損傷進一步惡化[1]。近年研究發現，腸道是失血性休克中器官功能障礙的始動器官和重要靶器官之一，腸黏膜屏障功能是影響失血性休克臨床轉歸的重要因素，因此保護腸黏膜屏障功能是改善失血性休克患者預后的關鍵措施[2]。

鹽酸戊乙奎醚是一種高選擇性抗膽堿能藥物，具有潛在的調控應激反應、穩定細胞膜、改善微循環等作用[3-5]，臨床已廣泛應用于膿毒癥、急性肺損傷的防治，但其對失血性休克導致的腸黏膜屏障功能損傷是否具有保護作用及其作用機制研究較少。本研究擬用大鼠失血性休克模型，觀察不同劑量鹽酸戊乙奎醚預處理對腸黏膜屏障功能損傷的防治作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型及分組

SD 大鼠，（320±20）g，2%戊巴比妥（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后置于仰臥位。按無菌術要求暴露右側股動脈并置管（PE-24G）用來放血和測壓；尾靜脈置管用來給藥、補液和輸血。在手術操作結束后，大鼠被隨機分配至4個組（n=8）：對照組、休克組、小劑量鹽酸戊乙奎醚組（0.15 mg/kg）、大劑量鹽酸戊乙奎醚組（0.30 mg/kg）。對照組和休克組通過尾靜脈在10 s內快速輸注0.5 mL生理鹽水；小劑量鹽和大劑量酸戊乙奎醚組給予0.5 mL包含相應劑量鹽酸戊乙奎醚的稀釋液。0.5 mL肝素鹽水（10 U/mL）用來確保鹽水或藥物進入到大鼠體內。30 min之后，按27 mL/kg經動脈通道在10 min之內勻速抽取血液誘發失血性休克，并通過放血或輸血使大鼠股動脈壓維持在（40±5） mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。維持休克狀態60 min后，抽取的血液和乳酸林格液 （32 mL/kg）在30 min之內通過尾靜脈勻速輸注到大鼠體內復蘇。復蘇4 h后處死大鼠取8 cm末端回腸進行檢測。

1.2 觀察指標

腸道中超氧化物歧化酶（SOD）和丙戊二醛（MDA）含量按試劑盒說明（建成生物制劑公司，南京，中國）使用酶標儀測定。線粒體蛋白含量用BCA法測定（貝斯特公司，上海，中國）。

采用硝酸鹽還原酶法測定一氧化氮（NO）；通過原子吸收分光光度法測定Ca2＋含量。Tonometry張力計置入乙狀結腸，依照Henderson-Hasselbach[6]方法觀察并計算pHi。使用標準的HE程序對組織進行染色并按Chiu法[7]對切片評分。TUNEL（羅氏生物試劑公司，德國）染色被用來檢測腸黏膜細胞凋亡。每張切片在熒光顯微鏡（尼康90i，尼康公司，日本）下隨機選擇5個視野（×400），計數陽性和陰性細胞核。以凋亡指數表示每張切片凋亡情況。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行處理。計量資料數據以均數±標準差（）表示，多組間的比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 復蘇4 h后大鼠腸黏膜中SOD和MDA含量

與對照組比較，休克組和大、小劑量鹽酸戊乙奎醚組均能顯著降低大鼠腸黏膜SOD活性并增加MDA濃度 （均P＜0.05）。與休克組比較，大劑量鹽酸戊乙奎醚組能顯著升高大鼠腸黏膜SOD活性并降低MDA濃度（P＜0.05），小劑量鹽酸戊乙奎醚對腸黏膜SOD和MDA無明顯影響 （P＞0.05）。見表 1。

表1 復蘇4 h后大鼠腸黏膜中SOD和MDA含量（）

表1 復蘇4 h后大鼠腸黏膜中SOD和MDA含量（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與休克組比較，#P＜0.05

組別 只數 SOD（nU/mL） MDA（nmol/mL）對照組休克組小劑量鹽酸戊乙奎醚組大劑量鹽酸戊乙奎醚組8888382.16±98.65268.88±90.24*288.54±89.76*325.77±72.13*#5.96±1.6810.71±1.72*9.96±1.74*7.73±1.56*#

2.2 復蘇4 h后大鼠腸黏膜中NO、Ca2+含量及pHi值

與對照組比較，休克組和大、小劑量鹽酸戊乙奎醚組均能顯著升高大鼠腸黏膜NO、Ca2＋含量并降低pHi值 （均P＜0.05）。與休克組比較，大劑量鹽酸戊乙奎醚組能顯著降低大鼠腸黏膜 NO、Ca2＋含量并升高 pHi值（P＜0.05），小劑量鹽酸戊乙奎醚對腸黏膜NO、Ca2＋含量及pHi值無明顯影響 （P＞0.05）。見表 2。

2.3 復蘇4 h后大鼠腸黏膜細胞凋亡率和HE含量評分

大劑量鹽酸戊乙奎醚預處理可抑制缺血再灌注所致的腸黏膜細胞凋亡（P＜0.05）。但小劑量鹽酸戊乙奎醚對腸黏膜細胞凋亡無明顯影響（P＞0.05）。大劑量鹽酸戊乙奎醚預處理顯著減輕缺血再灌注所致的腸黏膜病理學改變，降低切片HE評分（P＜0.05）。而小劑量鹽酸戊乙奎醚對腸黏膜病理學改變無明顯改變（P＞0.05）。見表3。

表2 復蘇4 h后大鼠腸黏膜中NO、Ca2+含量及pHi值（）

表2 復蘇4 h后大鼠腸黏膜中NO、Ca2+含量及pHi值（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與休克組比較，#P＜0.05

組別 只數 NO（μmol/g） Ca2＋（μmol/g） pHi對照組休克組小劑量鹽酸戊乙奎醚組大劑量鹽酸戊乙奎醚組888857.4±3.973.6±5.1*70.8±4.2*64.5±5.4*#2.27±0.322.93±0.35*2.74±0.39*2.44±0.29*#7.324±0.1026.978±0.152*7.022±0.105*7.192±0.118*#

表3 復蘇4 h后大鼠腸黏膜細胞凋亡率和HE評分（）

表3 復蘇4 h后大鼠腸黏膜細胞凋亡率和HE評分（）

注：與休克組比較，#P＜0.05

組別 只數 凋亡率（%） HE評分（分）休克組小劑量鹽酸戊乙奎醚組大劑量鹽酸戊乙奎醚組88818.26±9.6515.38±8.977.75±7.26#3.64±0.763.34±0.731.91±0.66#

3 討論

前期的研究已經證實鹽酸戊乙奎醚通過抑制NO和MDA的生成，并增加SOD活性來維持組織、器官的氧化平衡，從而在膿毒癥、急性肺損傷等應激事件中發揮器官保護作用[3-5，8]。在本實驗中，筆者發現大劑量鹽酸戊乙奎醚預處理顯著降低腸黏膜NO、MDA及Ca2＋的含量；增強SOD活性和pHi值；并降低腸黏膜細胞凋亡率及組織病理學評分。這些證據表明大劑量鹽酸戊乙奎醚預處理可減輕缺血再灌注所致的腸黏膜損傷。

在休克組，筆者發現腸黏膜MDA含量顯著增高而SOD活性顯著降低。MDA是脂質過氧化反應產物之一，因此MDA水平增高預示著腸黏膜結構的破壞；腸黏膜的通透性增加，最終導致腸黏膜功能障礙[9]。相反，SOD被認為是組織抗氧化損傷的關鍵酶之一，研究甚至發現抗氧化酶活性與生物體壽命存在密切相關[10]。先前的研究指出，鹽酸戊乙奎醚在缺血再灌注損傷中發揮抗氧化特性而對組織起保護作用[8]。在本實驗中，結果清晰顯示大劑量鹽酸戊乙奎醚預處理減少腸黏膜中脂質過氧化反應產物MDA含量而顯著增加SOD活性。提示大劑量鹽酸戊乙奎醚預處理有效保存腸黏膜的抗氧化功能，因此能有效抑制腸黏膜損傷。

NO是另一反映組織氧化平衡的重要指標，其過度表達可直接引起細胞毒作用或通過生成氧自由基從而抑制細胞線粒體的氧化呼吸作用，導致能量代謝障礙，細胞脂質過氧化損傷，最終引起腸黏膜損傷[11-12]。事實上，NO是否促進缺血再灌注腸黏膜損傷尚有爭議。有學者發現，NO可以增加腸黏膜血流量，促進黏膜潰瘍的修復，對胃腸道有保護作用[13]。盡管對于NO是否促進缺血再灌注腸黏膜損傷有爭議，但越來越多的證據表明NO促進缺血再灌注腸黏膜損傷[11-12]。在本實驗中，筆者也發現NO含量在腸黏膜損傷后呈現升高的趨勢，提示NO可能參與了缺血再灌注后小腸黏膜損傷這一過程；并且筆者還發現大劑量鹽酸戊乙奎醚預處理能有效抑制NO在腸黏膜中升高。

目前認為，細胞內鈣超載是細胞不可逆損傷的共同通路。休克再灌注后有效循環血容量不足、細胞缺氧，導致氧化還原功能失衡，大量氧自由基對細胞質膜和ER/SR膜的破壞，腸黏膜屏障受損，使大量的Ca2+從肌漿網釋放至胞漿內或胞外，黏膜細胞內外Ca2+含量均明顯增加[14]。細胞鈣含量的持續超載又促進細胞損傷，加重腸黏膜絨毛結構和黏膜屏障破壞[14]。本結果顯示，伴隨氧化還原功能失衡，休克組腸黏膜Ca2+濃度明顯升高，提示腸黏膜細胞功能受損或抑制。這與先前的研究結果是一致的。而鹽酸戊乙奎醚在先前的研究中可有效抑制缺血再灌注所致組織Ca2+濃度升高[15]；在此筆者同樣發現大劑量鹽酸戊乙奎醚預處理顯著抑制腸黏膜組織Ca2+濃度升高。

維持正常的氧化還原功能平衡和適當的Ca2+濃度是細胞生存的必要條件之一，而氧化還原功能障礙和Ca2+超載是導致細胞死亡常見原因。在休克組，筆者發現伴隨著腸黏膜中氧化還原功能失衡和Ca2+濃度增高的是細胞死亡的增加。與此相反的是，大劑量鹽酸戊乙奎醚預處理抑制了缺血再灌注所致的氧化還原功能失衡和Ca2+濃度增高，同時筆者也發現腸黏膜細胞凋亡被抑制，這可能是鹽酸戊乙奎醚發揮保護作用的機制之一。

缺血再灌注導致器官功能障礙的重要機制之一就是誘導大量的功能細胞死亡[1，16]。當缺血再灌注導致的細胞死亡被抑制，器官功能能得到有效改善[17]。鹽酸戊乙奎醚在先前的報道中有效抑制細胞死亡從而改善了缺血再灌注器官的功能[8]。在本實驗中，筆者發現與大劑量鹽酸戊乙奎醚抑制腸黏膜細胞凋亡一致，pHi和組織病理學得到顯著改善，提示腸黏膜功能得到保存。

在本實驗中，大劑量鹽酸戊乙奎醚預處理對休克大鼠腸黏膜提供有效的保護作用；抑制腸黏膜細胞死亡和保存抗氧化功能可能是鹽酸戊乙奎醚實現其保護作用機制之一。本實驗可能為改善失血性休克預后提供一種新的思路。

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