熊去氧膽酸對肝癌模型大鼠γ－谷氨酰轉移酶基因表達的影響

盛 瑜，韓國慶，秦成勇，任萬華，劉 慧，王夏青

山東大學附屬省立醫院1.感染性疾病科;2.消化內科，山東濟南250012

目前研究發現，在正常人肝細胞中存在γ-GGT不同的基因亞型:胎肝型(F)、胎盤型(H)、肝癌細胞型(P)亞型，并與肝癌發展密切相關［1］。根據國內外研究發現，熊去氧膽酸(UDCA)對人宮頸癌細胞有誘導凋亡作用，并可抑制致癌物對實驗動物的致癌作用［2-3］。在此基礎上，研究發現UDCA能選擇性誘導人肝腫瘤細胞凋亡及抑制增殖［4］。在上述系列研究中，本實驗主要研究UDCA對大鼠肝癌模型中肝癌標志物GGT基因表達的影響作用，進一步探討UDCA對肝癌預防作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 Wister大鼠106只，雄性，年齡3.5個月，體質量(95.9±5.6)g，購于山東大學動物實驗中心。二乙基亞硝胺(DEN)，UDCA及逆轉錄酶和PCR試劑，均為Sigma產品。

1.2 大鼠肝癌模型的建立 將106只Wister大鼠隨機分成5組:① 模型組28只;② UDCA實驗A組28只;③UDCA實驗B組28只;④正常對照組11只;⑤UDCA對照組11只。①②③組為實驗組，④⑤組為對照組。模型組在正常飲水、進食狀態下飼養2周，于第3周開始給予每只大鼠腹腔注射DEN溶液(2 g/L)，劑量為20 mg/kg，每周1次，共2周;于第5周增加DEN劑量為40 mg/kg;第7周始增加DEN劑量為60 mg/kg，按上述方法注射2周。之后在正常飲食下飼養至20周，總時間為28周。UDCA實驗A組將UDCA用飲用水配成2 g/L的濃度，給大鼠飲用2周，于第3周給予腹腔注射DEN溶液，劑量、用法和時間與模型組相同。UDCA實驗B組UDCA的濃度增加為5 g/L，其他處理與UDCA實驗A組相同。正常對照組不給予大鼠任何處理。UDCA對照組除不用DEN腹腔注射外，其余處理同UDCA實驗B組。

1.3 大鼠的處死及處理 大鼠肝組織的采集:將大鼠處死，取各組大鼠肝組織、癌周組織及癌組織標本，以無RNA酶的三蒸水沖洗后置于EP管中，轉移至－80℃冰箱保存，供提取GGT mRNA。血液標本的采集:處死大鼠時，抽取腹主動脈血，枸櫞酸鈉抗凝，分離血液中的單個核細胞(PMNs)，再提取其總RNA，經逆轉錄合成cDNA放入－80℃冰箱保存。

1.4 GGT mRNA各亞型的引物 (由上海生工生物工程公司合成)，GGT mRNA各亞型引物序列如下:F亞型:上游 5'-CACAGGGGACATACAGTGAG-3'，下游5'-GAAATAGCTGAAGCACGCGC-3';H亞型:上游 5'-GGATTCTCCCAGAGATTGCC-3'，下 游 5'-GGAGGTCAAGGG AGGTTACC;P亞型:上游5'-GCCCAGAAGTGAGAGCAGTT-3'，下 游 5'-TCCAGAAAGCAGCTAGA GGG-3';β-actin:上游 5'-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3'，下游 5'-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3'。

1.5 PT-PCR方法 對血液標本，用淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(PMNs)。對肝組織標本，在冷凍狀態下剪取50～100 mg肝組織，提取RNA，合成cDNA，然后進行PCR基因擴增，反應條件均為:預變性94℃ 3 min;變性94℃ 30 s，退火58℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，循環30次;最后72℃ 延伸8 min，得到反應終產物，預期終產物分子大小。

1.6 統計學分析 以SPSS 13.0統計軟件分析。計數資料用χ2檢驗;計量資料先行正態性檢驗，正態分布的計量資料以±s表示，多組間的比較采用單因素方差分析LSD法。以 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DEN誘癌過程中GGT基因的表達及其與人類GGT基因表達的異同 模型組8只非肝癌大鼠、20只肝癌大鼠(取其癌周組織、癌組織)及正常對照組的11只正常大鼠肝組織3種GGT mRNA亞型，分析結果:正常肝組織中只檢出F亞型(100%);非肝癌肝組織F亞型的陽性率與正常大鼠相同，但H亞型的檢出率明顯高于正常大鼠(P＜0.05)(此點與人類不同);癌周組織F亞型的分布與非肝癌及正常大鼠相似，但H亞型陽性率明顯高于正常及非肝癌大鼠;癌組織F亞型陽性率顯著低于其他3組，H亞型陽性率明顯高于正常及非肝癌大鼠，與癌周組織相似(P＜0.05);在大鼠肝組織中未檢測出P亞型(此點與人類不同)(見表1、圖1)。

表1 大鼠不同類型肝組織GGT基因(F、H)的表達Tab 1 GGT gene expression(F，H)in rat different liver tissues

圖1 大鼠不同類型肝組織GGT基因亞型的分布情況Fig 1 GGT gene subtypes distribution in rat liver tissues

2.2 實驗大鼠血液中GGT mRNA亞型的表達 通過對模型組中8只非肝癌大鼠、20只肝癌大鼠和正常對照組中11只正常大鼠腹主動脈血液的GGT基因亞型檢測，結果發現正常及非肝癌大鼠血液中未檢出GGT mRNA各亞型;在肝癌大鼠的血液中GGT mRNAH的檢出率為40%，明顯高于非肝癌及正常大鼠。

2.3 UDCA對實驗大鼠肝組織GGT基因表達的影響 通過對各組實驗大鼠肝組織、癌周組織和癌組織GGT mRNA H和F亞型的半定量PT-PCR分析發現:UDCA實驗A、B組的非肝癌大鼠肝組織、肝癌大鼠的癌周圍組織和癌組織的GGT mRNA-H亞型的表達量均較模型組明顯下降(P＜0.05);UDCA實驗A、B組癌組織F亞型的表達量較模型組顯著提高;正常對照組與UDCA對照組相比較，H及F亞型的表達量相似(P ＜0.05，見表2、3)。

表2 UDCA對大鼠肝組織GGT mRNA-H表達的影響Tab 2 The expression of GGT mRNA-H by UDCA in rat liver tissues

表3 UDCA對大鼠肝組織GGT mRNA-F表達的影響Tab 3 The expression of GGT mRNA-F by UDCA in rat liver tissues

2.4 UDCA對大鼠血液GGT mRNA-H表達的影響通過對模型組，UDCA實驗A、B組中發生癌變的大鼠血液的GGT mRNA-H的基因半定量分析顯示:UDCA實驗A、B組的GGT mRNA-H表達量較模型組明顯減少(P ＜0.05，見表4)。

表4 UDCA對大鼠血液GGT mRNA-H表達的影響Tab 4 The expression of GGT mRNA-H by UDCA in rat blood

3 討論

肝癌發生的分子機制根本原因在于癌基因及癌相關基因的激活及抑癌基因的失活，使調控發生異常，導致癌變［5］。GGT在正常肝組織GGT活性較低，肝細胞發生癌變時，肝GGT重新大量表達，并且出現較明顯的異質性改變［6-7］。本實驗成功建立大鼠肝癌模型，通過化學誘癌，導致原癌基因和(或)抑癌基因失活，發生癌變。化學致癌劑在體內通過酶的作用將其轉變為很強的親電子劑，它與膜結合的GGT有高度的親和力和反應力。當肝組織癌變時，可產生和分泌與肝癌相關的GGT，被認為是肝癌發生的早期標志酶。

γ-GGT既與生物轉化、核酸代謝及腫瘤發生有關，又是反映肝細胞實質惡性病變的靈敏標志酶［8］。肝臟GGT基因亞型分為3種:胎肝(F)、胎盤(P)和肝癌細胞型(H)亞型。人胎肝及肝癌組織GGT約為正常肝的3～13倍。鼠肝癌的研究發現，肝癌組織及胎鼠GGT的比活性甚高，約為正常鼠肝GGT的100倍。本研究通過DEN誘發大鼠肝癌模型，其與人的肝細胞癌比較相似，實驗證明正常肝、非肝癌組織及癌周組織主要表達F亞型;肝癌組織中H亞型陽性率明顯高于非腫瘤組，而F亞型的陽性率明顯低于非腫瘤組;癌周組織F亞型陽性率與非腫瘤組相似。在癌變大鼠的血液中均可檢出GGT mRNA-H亞型，而非肝癌者血液中未檢出H亞型。F及P亞型均未檢出，說明人與大鼠血液中GGT基因亞型的分布是相近的。由此我們可以推測在肝癌發生過程中存在著GGT mRNA由F亞型向H亞型的轉變，肝細胞的F亞型向H亞型的轉化可能發生于癌前期病變。而在血液中檢出H亞型是血液中存在肝癌細胞的標志，說明GGT mRNA-H亞型的表達可能成為肝癌早期的靈敏指標。實驗證明大鼠與人的GGT的基因表達的結果相一致。

目前認為，熊去氧膽酸是臨床上用于利膽、保護細胞及免疫調節等作用的一線藥物。UDCA能減少結腸癌的發生，抑制致癌物對實驗動物的致癌作用。本實驗已證實大鼠與人的GGT mRNA表達結果是一致的。通過研究發現UDCA可以減少DEN誘癌過程中大鼠肝組織、癌周組織及癌組織GGT mRNA-H亞型的表達水平，而GGT mRNA-H亞型的表達與肝癌的發生及癌前病變有密切關系，與我們先前的實驗研究UDCA可以減少大鼠癌結節的數量、降低AFP水平的結果相一致。進一步說明UDCA能減少肝癌的發生，對預防肝癌有一定的作用，并且UDCA也降低血液中GGT mRNA-H的表達水平，而血液中GGT mRNA-H亞型是血液中存在肝癌細胞的標志，說明UDCA可以減少肝癌大鼠血液中肝癌細胞的數量，提示其具有預防或減少實驗大鼠血液播散的作用。綜上所述，UDCA可以減少實驗大鼠肝組織及血液中GGT mRNA-H亞型的表達，提示UDCA具有預防或減少肝癌發生和血液播散的作用。

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