miRNA181a在肝細胞癌中的表達及其臨床意義

夏永欣，張金平

1.南陽市中心醫院消化內科二病區，河南南陽473009;2.鄭州大學第一附屬醫院消化內科

在世界范圍內，肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發病率位于腫瘤發病率第5位，其死亡率在消化系統惡性腫瘤中占第3位［1-3］。HCC死亡率已占我國惡性肝病死因的第2位，在農村中則為第1位。miRNA是近年來發現于真核細胞中的一類內源性非編碼小分子RNA，長約21～22個核苷酸，可通過與靶mRNA的3'UTRs(untranslated regions)或5'UTRs近乎完全互補結合在轉錄后水平使其降解，或者與之不完全互補結合在翻譯水平抑制蛋白合成，從而在基因表達中發揮重要的調節作用［4-5］。

我們新近研究發現惡性程度較低的Hep3B細胞與侵襲力更強的HepG2細胞相比較:miRNA181a表達明顯上調。本研究檢測肝細胞癌、癌旁組織和正常肝組織中miRNA181a的表達水平，探索分析miRNA181a表達異常與肝細胞癌病理學特征如腫瘤大小、腫瘤分化程度、臨床分期、是否合并肝硬化、血AFP濃度等的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集南陽市中心醫院及鄭州大學第一附屬醫院普外科2010年5月－2011年5月手術切除HCC標本30例，癌旁組織取自距離癌組織2 cm的肝臟組織，所有病例均經病理證實。其中男22例、女8例，平均年齡(50±10.60)歲。術中、術前均未經放、化療及免疫治療。另取來源于肝血管瘤患者的正常肝組織10例作為對照。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及質量檢測:按照TRIzol?試劑(Invitrogen life technologies)說明書的步驟，逐步提取出組織標本中的總RNA。應用紫外分光光度計測定總RNA的吸光度A260值和A280值，用A260值計算其濃度，并計算A260/A280值檢測其純度。

1.2.2 實時定量PCR檢測目的miRNA表達量:取2 μg總RNA作為初始模板，總反應體系為20 μL，應用miScript Reverse Transcription Kit說明書進行逆轉錄合成cDNA，反應條件為:37℃，60 min;95℃，5 min。然后取1 μL上述cDNA為模板，以U6 SnRNA作為內參照，每個檢測樣本做3個復孔，在Rotor-Gene 3000 Real-time PCR儀(Corbett Research)上進行實時定量PCR，反應條件為:95℃預熱15 min;95℃，10 s;58℃，30 s;72℃，30 s，35個循環;實驗中所用引物均由Invitrogen公司合成。

1.3 統計學分析 采用內參基因U6 SnRNA標化、計算每一種被檢miRNAs的△Ct值。應用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝細胞癌組織中miR-181a基因表達量的比較與癌旁組織相比，30例HCC組織中有13例miR-181a基因表達上調，占43.33%(13/30)，17例表達下調，占56.67%(17/30)，兩組相比，差異有統計學意義。與正常肝臟組織相比，30例HCC組織中有23例miR-181a基因表達下調，占76.67%(23/30);7例表達上調，占23.33%(7/30)。miR-181a基因在HCC組織中的表達量低于正常肝組織(P＜0.01)。肝癌組織中miR-181a與癌旁組織相比無顯著性差異(P＞0.05);與正常組織相比具有顯著性差異(P＜0.01，見圖1)。

圖1 miR-181a相對表達量 HCC:肝癌組織;NT:癌旁組織;NL:正常肝組織Fig 1 The relative expression of miR-181a in different liver tissues

2.2 miR-181a基因表達相對倍數與腫瘤病理學特征的關系 miR-181a表達下調與臨床分期、HCC分化程度和合并肝硬化明顯相關(P＜0.05)。而miR-181a基因表達上調與肝細胞癌的大小、血AFP濃度、是否并發HBV感染均無明顯相關性(P＞0.05，見表1)。

3 討論

表1 miR-181a基因表達相對倍數與腫瘤病理學特征的關系Tab 1 The relationship of the miR-181a expression and pathological characteristics of HCC

研究表明，在多種腫瘤中存在miRNA的異常表達;此外亦發現miRNA的靶基因中有許多作用于腫瘤相關的信號轉導通路，提示miRNA與腫瘤發生及轉移有密切的關系［6-7］。目前研究已表明miRNA參與了HCC的發生及轉移過程［8-11］。許多基礎和臨床研究認為miRNAs可能是一組新的致癌基因或抑癌基因。miRNAs既可作為抑癌基因，下調原癌基因的活性;也可作為癌基因，下調抑癌基因的活性。我們實驗室前期的研究發現，miR-181a能在體外培養的肝癌細胞中調節骨橋蛋白依賴的肝癌轉移［12］。Frueht等［13］用弗斯可林(forskolin)處理內耳細胞，檢測基因表達變化，發現miR-181a表達變化，功能實驗顯示miR-181a能促進聽毛細胞的增殖。最近的研究顯示miR-181a能與凋亡相關的mRNA Bim靶相結合，抑制套細胞淋巴瘤或非Hodgkin淋巴瘤細胞的化療相關的凋亡，從而抑制淋巴瘤細胞對化療藥的敏感性［14］。本研究從臨床標本水平，研究miR-181a在肝癌組織中的表達量與腫瘤病理學特征的關系，結果發現癌組織與癌旁組織及正常組織相比，miR-181a表達顯著下調。我們研究結果進一步發現肝細胞癌miR-181a表達量與腫瘤分化程度、臨床分期和合并肝硬化明顯相關。究其詳細機制尚不十分清楚。推測可能由于miR-181a作用于轉錄因子EZF家族，進一步促使癌細胞從G1期向S期的轉變，促進細胞增殖，抑制細胞分化。目前還沒有miR-181a表達與肝細胞癌腫瘤病理學特征的關系方面的研究報道。miR-181a的作用機制值得進一步深入研究。

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