紫藤瘤提取物抗病原真菌活性研究

吳培云， 劉勁松， 陳愛民， 鐘文武， 王 剛

(安徽中醫(yī)學院藥學院，現(xiàn)代中藥安徽省重點實驗室，安徽合肥230031)

紫藤Wisteria sinensis(Sims)Sweet是一種常見的園林綠化植物，屬豆科紫藤屬，是一種落葉攀援纏繞性的大藤本植物。羅充等［1］研究發(fā)現(xiàn)紫藤等園林植物有殺菌作用，紫藤葉片丙酮提取液對真菌和細菌的生長均有一定的抑制作用［2］。紫藤瘤是紫藤老藤莖上所生的贅瘤，具體形成機理尚不明確。紫藤瘤可入藥，有殺蟲、止痛、解毒等功效［3］，中醫(yī)臨床上可用于癌癥的治療［4-5］。植物在生命過程中受到病原真菌、細菌、昆蟲和動物的咬食等多重脅迫，誘導次生代謝產(chǎn)物的發(fā)生和積累［6-8］。紫藤瘤的產(chǎn)生機理雖不清楚，但我們推測這樣的一個贅瘤組織對紫藤自身的化學防御應(yīng)該有一定的積極生理意義。基于這樣的思路，我們選擇病原真菌、細菌對紫藤瘤提取物進行抑菌活性研究，以期揭示紫藤瘤這種特殊藥材的形成機理，為該藥材的品質(zhì)保證及質(zhì)量控制提供一些思路。

1 材料

1.1 紫藤瘤 紫藤瘤藥材由安徽中醫(yī)學院中藥教研室方成武教授提供，并鑒定為豆科植物紫藤Wisteria sinensis(Sims)Sweet的藤瘤。

1.2 作物病原真菌 小麥赤霉病菌Gibberella zeae、棉花枯萎病菌Fusa-rium oxysporum f.sp.vasinfectum、辣椒枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.capsicum、玉米穗腐病菌Fusarium monilifome、油菜菌核病菌Sclerotiorum sclerotiorum由河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院中藥材系實驗室提供。

1.3 細菌 大腸桿菌Escherichia coli、金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus、枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis、巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium、蘇云金桿菌Bacillus thuringiensis、熒光假單胞桿菌Pseudomonas fluorescens由河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院中藥材系實驗室提供。

1.4 PDA固體培養(yǎng)基 馬鈴薯 (去皮)200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1000 mL。馬鈴薯煮30 min，4層紗布過濾，取汁，加入葡萄糖和瓊脂，煮至瓊脂完全融化，補水至1000 mL。常規(guī)分裝，121℃高壓滅菌30 min。

1.5 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 30 g牛肉膏，5 g蛋白胨，15 g瓊脂，5g氯化鈉，蒸餾水1000 mL，用1 mol/L NaOH將其pH調(diào)至7.0～7.2。常規(guī)分裝，121℃高壓滅菌30 min。

1.6 試劑 二甲基亞砜、葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、氫氧化鈉，均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 紫藤瘤樣品提取 取粉碎后的紫藤瘤粉末100 g，用10倍 (體積/質(zhì)量)的乙醇于1000 mL三角瓶內(nèi)室溫浸提24 h，期間不時攪拌，共浸提兩次，合并浸提液，過濾，45℃下減壓濃縮，得到紫藤瘤乙醇提取物約12 g。

2.2 藥液的制備 取適量紫藤瘤乙醇提取物放入量瓶，加入微量二甲基亞砜，振蕩混勻，無菌水定容，配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL、2.5 mg/mL溶液。

2.3 體外抗作物病原真菌活性試驗

2.3.1 抑菌試驗方法 菌落生長速率法［9］:取1 mL供試藥液，與9 mL的PDA培養(yǎng)基于無菌試管中混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿中制成帶藥的培養(yǎng)基平板，無菌水作空白對照。用無菌打孔器在活化后的作物病原真菌菌落邊緣切下直徑6 mm生長一致的菌餅。將打好的菌餅菌絲面向下，接于培養(yǎng)基平板中心，使菌絲與新鮮培養(yǎng)基充分接觸，防止感染其它雜菌，封口膜封口，然后于26℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d。每個試驗重復3次。

2.3.2 抑菌結(jié)果測量 采用十字交叉法，待空白對照菌落長至平板邊緣時，測量各培養(yǎng)皿中的菌落生長直徑，以3次重復菌落直徑的平均值計算菌絲生長抑制率。菌絲生長抑制率 (I)=［空白對照菌落生長直徑 (C)-處理菌落生長直徑 (T)］ /［空白對照菌落生長直徑 (C) －6］ ×100%，即:

其中，6是菌餅直徑，單位為mm。

2.4 體外抗細菌活性試驗

2.4.1 菌懸液的制備 用接種環(huán)挑取活化后生長良好的細菌，放入10 mL無菌水中，振蕩混勻，用血球計數(shù)法確定菌懸液濃度，稀釋至106～108cfu。

2.4.2 抑菌試驗方法 采用濾紙片法［10］，用直徑6 mm的打孔器打好濾紙片后121℃滅菌30 min，烘干后浸泡在供試藥液中30 min。用鑷子取出濾紙片，稍晾干后備用。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒入無菌平皿中，每皿約15 mL，凝固后，加入0.1 mL制備好的菌懸液，用涂布棒涂布均勻，然后貼制備好的含藥濾紙片，濾紙片距平皿邊緣1.5 cm以上，各濾紙片之間距2.5 cm以上。置于36℃恒溫培養(yǎng)20～24 h。每個試驗重復3次。

2.4.3 抑菌結(jié)果測量 采用十字交叉法［11］，測量培養(yǎng)皿中各濾紙片的抑菌圈直徑，以3次重復的平均值為抑菌圈直徑，單位為mm。抑菌圈直徑在小于6 mm為無抑菌，6～8 mm為微弱抑菌，8～13 mm為弱抑菌，13～18 mm為中等抑菌，大于18 mm則為強抑菌。

3 結(jié)果與討論

3.1 體外抗作物病原真菌活性結(jié)果 紫藤瘤乙醇提取物無論是5 mg/mL還是2.5 mg/mL都對油菜菌核病菌Sclerotiorum sclerotiorum、小麥赤霉病菌Gibberella zeae、棉花枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum、辣椒枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.capsicum、玉米穗腐病菌 Fusarium monilifome 5種作物病原真菌均有較好的抑菌效果，尤其對前3種病原真菌的抑制作用顯著，見圖1。

圖1 紫藤瘤乙醇提取物對病原真菌體外抑制效果

紫藤瘤乙醇提取物抑制作物病原真菌具有一定的選擇性，質(zhì)量濃度為5 mg/mL對油菜菌核病菌的抑制最強，高達63.9%，對辣椒枯萎病菌的抑制最弱，抑菌率為27.1%。另外，紫藤瘤乙醇提取物抑菌試驗中的3次重復數(shù)據(jù)離散度好，在抑菌率平均值的上下8%以內(nèi)，反映了本試驗方法學的穩(wěn)定性。紫藤瘤乙醇提取物對5種作物病原真菌抑制率的高低順序為:油菜菌核病菌﹥棉花枯萎病菌﹥小麥赤霉病菌﹥玉米穗腐病菌﹥辣椒枯萎病菌。油菜菌核病菌對紫藤瘤乙醇提取物不同質(zhì)量濃度敏感性大，2.5 mg/mL紫藤瘤乙醇提取物對其抑菌率僅為32.1%，和5 mg/mL的抑菌率相差31.8%。而其他4種病原真菌對紫藤瘤乙醇提取物的不同質(zhì)量濃度敏感性差，2.5 mg/mL的抑菌率和5 mg/mL的抑菌率相差5%以內(nèi)。見表1。在本次實驗中沒有采用抗真菌陽性藥物作對照是因為紫藤瘤的提取物成分復雜，而對照藥是單一化合物，它們之間的活性不能進行量化比較，只有分離得到單體化合物之后才方便進行活性的大小比較。另外，本次實驗的主要目的是基于紫藤化學生態(tài)防御的觀點初步研究紫藤瘤是否有抗病原真菌的活性，為今后深入的研究提供一些思路。

表1 紫藤瘤乙醇提取物對作物病原真菌體外抑制率

3.2 體外抗細菌活性結(jié)果 紫藤瘤乙醇提取物在5 mg/mL和2.5 mg/mL質(zhì)量濃度下對大腸桿菌Escherichia coli、金黃色葡萄球菌 Staphyloccocus aureus、枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis、巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium、蘇云金桿菌Bacillus thuringiensis、熒光假單胞桿菌Pseudomonas fluorescens都無明顯抑菌效果。

4 結(jié)論

本研究中紫藤瘤乙醇提取物對5種作物病原真菌有較好的抑菌效果，在5 mg/mL時對油菜菌核病菌、棉花枯萎病菌、小麥赤霉病菌的抑菌率高達50%左右，有繼續(xù)深入研究的價值。紫藤瘤乙醇提取物5 mg/mL和2.5 mg/mL質(zhì)量濃度下對棉花枯萎病菌、小麥赤霉病菌、玉米穗腐病菌、辣椒枯萎病菌4種作物病原真菌的抑菌率相差在5%以內(nèi)，可見紫藤瘤乙醇提取物的抗真菌效果穩(wěn)定。紫藤瘤乙醇提取物中的抑菌活性成分的分離、鑒定以及量效關(guān)系研究等還有待進一步的深入探討。另外，有人認為紫藤瘤的產(chǎn)生可能是細菌寄生紫藤莖所致的植物病瘤［12-13］，但本次實驗中并未見紫藤瘤提取物有明顯的抑制細菌的作用。

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