HPLC法同時測定蝎龍酒中芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸

王亞洲

(廣西醫科大學第四附屬醫院，廣西 柳州 545005)

HPLC法同時測定蝎龍酒中芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸

王亞洲

(廣西醫科大學第四附屬醫院，廣西 柳州 545005)

目的建立蝎龍酒(全蝎、當歸、白芍、紅花、地龍、威靈仙、杜仲等)中芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸的測定方法。方法采用反相高效液相色譜法進行定量分析，用Inertsil C8-3柱，乙腈-0.1%磷酸-四氫呋喃(18∶80∶2)為流動相，體積流量為1.0 mL/min，檢測波長為340 nm。結果芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸的線性范圍分別為46.69～466.95 μg/mL、11.13～111.35 μg/mL和4.84～48.4 μg/mL;平均加樣回收率分別為101.08%、99.85%和100.34%(n=6)。結論此法簡便、準確，具有良好的重復性和回收率，適用于蝎龍酒中3種成分的同時測定。

高效液相色譜法;蝎龍酒;芍藥苷;羥基紅花黃色素A;阿魏酸

蝎龍酒為廣西醫科大學第四附屬醫院院內制劑，處方包括全蝎、當歸［1］、白芍［1］、紅花［1］、地龍、威靈仙、杜仲等數味中藥，有解毒止痛、強筋健骨、活血通經等功效，臨床用于治療各種風濕痹痛所致四肢麻木、腰膝酸痛、骨質增生、跌打損傷、中風后遺癥、偏頭痛等，療效明顯［2-3］，副作用小。原質量標準中僅對白芍進行鑒別，規定總固體量不少于1%，并無定量測定內容。為進一步提高本制劑質量標準，更有效地控制成品質量，本實驗參閱有關文獻［4-6］，經反復摸索，建立一種高效液相色譜測定方法，可以同時測定蝎龍酒中芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸3種成分。

1 儀器與試藥

LC—10ATvp高效液相色譜儀(SHIMADZU公司);752型紫外分光光度計(南京麒麟公司);AB—L電子分析天平(梅特勒-托利多公司);MP511電子pH計(上海三信公司)，B2500S型超聲波清洗器(BRANSON公司)。芍藥苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110736-200630);羥基紅花黃色素A對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號20110311);阿魏酸對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號20110406);甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為重蒸餾水，蝎龍酒(本院制劑室自制，批號:110809、110822、110830)。

2 試驗方法與結果

2.1 色譜條件及系統適用性實驗Inertsil C8-3柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈-0.1%磷酸-四氫呋喃(18∶80∶2);檢測波長340 nm;柱溫30℃;體積流量1.0 mL/min;進樣量20 μL。在此色譜條件下，芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸均能夠達到基線分離，其它成分對測定沒有干擾。芍藥苷保留時間約為8.4 min，羥基紅花黃色素A保留時間約為10.7min，阿魏酸保留時間為14.1min。見圖1。

圖1 供試品(A)、陰性對照品(B)和對照品(C)高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of sample(A)，negative sample(B)and mixed reference substances(C)

2.2 對照品溶液的制備稱取經五氧化二磷減壓干燥至恒質量的芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸對照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL分別含芍藥苷1 867.8 μg、羥基紅花黃色素A 445.4 μg和阿魏酸193.6 μg，即得。

2.3 供試品溶液的制備精密稱取蝎龍酒10 mL，置于100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4 陰性對照品溶液的制備按照處方組成，取除白芍、紅花和當歸以外的其余藥材，按工藝要求制成不含芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸的合劑，按照供試品溶液制備項下的方法，即得陰性對照品溶液。

2.5 線性范圍考察取上述混合對照品溶液適量，用50%甲醇稀釋成6個質量濃度，即得芍藥苷質量濃度分別為46.69、93.39、186.78、280.17、373.56、466.95 μg/mL，羥基紅花黃色素A質量濃度分別為11.13、22.27、44.54、66.81、89.08、111.35 μg/mL，阿魏酸質量濃度分別為4.84、9.68、19.36、29.04、38.72、48.4 μg/mL的溶液。依次進樣，按上述色譜條件測定，再分別以3成分的進樣質量濃度為橫坐標，以相應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸的回歸方程分別為:Y=10 216X+769，r=0.999 7(n=6);Y=24 753X+1 975，r=0.999 5(n=6);Y=83 437X－5 612，r=0.999 4(n=6)。結果表明，3成分的線性范圍分別為46.69～466.95 μg/mL、11.13～111.35 μg/mL和4.84～48.4 μg/mL。

2.6 進樣精密度試驗分別取上述混合對照品溶液1 000、500、200 μL，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成高、中、低3種質量濃度。分別在同日內連續進樣5次，計算日內精密度，結果芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸的RSD值分別為1.21%、1.07%和1.49%(n=5);在5日內連續進樣5次，計算日間精密度，結果三者的RSD值分別為1.96%、2.351%和2.14%(n=5)，說明本法進樣精密度良好。

2.7 重復性試驗取同一批(批號:110809)蝎龍酒，按供試品溶液制備方法制得6份，再按照上述色譜條件測定。測得芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸的RSD值分別為0.77%、1.26%和1.04%，說明本法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗取已知含有量的同一批(批號:110809)蝎龍酒6份，分別置于量瓶中，再加入一定量的混合對照品溶液，按供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，并按上述色譜條件進行測定。計算結果見表1。

2.9 樣品測定按2.3項供試品溶液的制備方法制備3批蝎龍酒供試品溶液，每批進樣5次，按上述色譜條件測定，計算供試品溶液的質量濃度，結果見表2。

表1 加樣回收率試驗結果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

表2 樣品測定結果(n=5)Tab.2 Results of sample assay(n=5)

3 討論

HPLC法同時測定制劑中幾種成分，選擇合適的檢測波長尤為關鍵。本實驗將芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸的對照品溶液分別進行全波長紫外掃描，確定芍藥苷最大吸收波長為230 nm，羥基紅花黃色素A最大吸收波長為403 nm，阿魏酸的最大吸收波長為327 nm。在上述色譜條件下，分別于230 nm、300 nm、327 nm、340 nm和403 nm等處對供試品溶液進行分析，發現阿魏酸最大吸收波長327 nm附近的340 nm處所得的HPLC圖譜上各成分峰分離效果較好，雜質干擾峰亦被消除，且能較好地兼顧含有量較小的阿魏酸和羥基紅花黃色素A的峰形，因此選擇340nm作為檢測波長。

參考有關文獻［7-9］，經過不同流動相的摸索，發現乙腈-0.1%磷酸-四氫呋喃(18∶80∶2)為測定流動相時，3成分的出峰時間更合適，峰形好、無拖尾，且不受雜質峰干擾。在流動相中少量加入的四氫呋喃，很好的改善了峰形。但四氫呋喃容易與流動相中的溶解氧形成有紫外吸收的絡合物，此絡合物會提高背景吸收(特別是在260 nm以下)，導致檢測靈敏度的輕微降低［10］，所以試驗流動相必須預先徹底脫氣。四氫呋喃易被氧化從而可能在色譜圖中產生倒峰，故添加四氫呋喃的流動相宜現用現配。

反相高效液相色譜法同時測定中藥合劑中芍藥苷、羥基紅花黃色素A和阿魏酸在國內尚未見文獻報道，本實驗建立的測定方法靈敏度高、專屬性好，為其它制劑的HPLC法測定上述3種成分提供了方法參考。相比于文獻［11-12］中的調pH再乙醚萃取法，本試驗中僅需對合劑稀釋即可進行定量測定，操作簡便易行。對3批樣品分別進行分析，測定結果準確、重復性好，說明本法可作為控制蝎龍酒質量的定量方法。

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］．北京:中國醫藥科技出版社，2010．

［2］楊春旭，戴盛明，李桂生．蝎龍酒對血瘀大鼠血液流變學及正常大鼠血小板功能影響的實驗研究［J］．廣西醫學，2002，24(6):763-764．

［3］朱靈，楊春旭，黎淵弘，等．蝎龍液浸膏體內外對動物凝血功能及血栓形成的影響［J］．現代中藥研究與實踐，2008，22(4):22-24．

［4］凌明，馬安宇．HPLC測定胃腸合劑中芍藥苷和黃芩苷的含量［J］．中成藥，2008，30(9):1311-1313．

［5］黃安軍，聶曉玲．HPLC法同時測定乳核內消液中芍藥苷和阿魏酸的含量［J］．西北藥學雜志，2009，24(6):436-437．

［6］倪文澎，錢平，周琴妹，等．RP-HPLC法同時測定養生丸中芍藥苷和阿魏酸的含量［J］．中國藥師，2010，13(8):1114-1116．

［7］李生有．HPLC測定丹夏頭痛膠囊中阿魏酸的含量［J］．中成藥，2007，29(2):附6-附7．

［8］王玉華，郝美玲，王偉．HPLC測定蒙成藥檀香清肺二十味丸中羥基紅花黃色素A的含量［J］．中成藥，2008，30(1):143-144．

［9］劉巖，劉順航，賈佳麗，等．HPLC同時測定廣東湯中葛根素和芍藥苷的含量［J］．中成藥，2007，29(6):842-845．

［10］張慶合．高效液相色譜實用手冊［M］．北京:化學工業出版社，2008，83．

［11］梁陳方，楊春旭，吳洪文，等．高效液相色譜法測定蝎龍酒中阿魏酸的含量［J］．時珍國醫國藥，2009，20(7):1661-1662．

［12］吳洪文，李明艷．高效液相色譜法測定蝎龍酒中芍藥苷的含量［J］．中國醫院藥學雜志，2010，30(17):1486．

Simultaneous determination of paeoniflorin，hydroxysafflor yellow A and ferulic acid in Xielong Liquor by HPLC

WANG Ya-zhou
(The No.4 Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Liuzhou 545005，China)

AIMTo establish a method for determining the contents of paeoniflorin，hydroxysafflor yellow A and ferulic acid in Xielong Liquor(Scorpio，Angelicae sinensis Radix，Paeoniae Radix alba，Carthami Flos，Pheretima，Clematidis Radix et Rhizoma，Eucommiae Cortex，etc．)．METHODSThe quantitative analysis was carried out by HPLC with an Inertsil C8-3column．The mobile phase was acetonitrile-0.1%phosphoric acid-tetrahydrofuran(18∶80∶2)with a flow rate at 1.0 mL/min．The detection wavelength was set at 340 nm．RESULTSThe linear ranges for paeoniflorin，hydroxysafflor yellow A and ferulic acid were 46.69-466.95 μg/mL，11.13-111.35 μg/mL and 4.84-48.4 μg/mL，respectively．Their average recoveries were 101.08%，99.85%and 100.34%(n=6)，respectively．CONCLUSIONThis method is simple and accurate，with good reproducibility and recovery．It is suitable for the determination of the contents of paeoniflorin，hydroxysafflor yellow A and ferulic acid in Xielong Liquor．

HPLC;Xielong Liquor;paeoniflorin;hydroxysafflor yellow A;ferulic acid

R927.2

A

1001-1528(2012)10-1925-04

2012-01-13

廣西科技廳攻關基金資助項目(9920028);廣西柳州市科技局科技攻關基金資助項目(990608)

王亞洲(1979—)，男，碩士，主管藥師，從事藥品質量控制工作。Tel:(0772)3802560，E-mail:lzpharmacy@163．com