不同提取方法制備的葛根芩連配方顆粒抑菌藥效研究

陳麗紅， 唐于平， 王 強

(1.南京中醫藥大學藥學院，江蘇南京210046;2.南京中醫藥大學江蘇省方劑研究重點實驗室，江蘇南京210046;3.中國藥科大學中藥分析教研室，江蘇南京210009)

葛根芩連湯來源于東漢末年張仲景所著的《傷寒論》。其組成為:葛根半斤，甘草二兩 (炙)，黃芩三兩，黃連三兩［1-3］。葛根芩連湯具有解肌、清熱、止瀉止痢之功效，臨床用于泄瀉痢疾、身熱煩渴、下痢臭穢、菌痢、腸炎等［4］。葛根芩連湯藥味較少，作用明確，是中醫藥的經典方劑，一直是研究的熱點。湯劑為葛根芩連湯原始劑型，目前已經上市的葛根芩連方劑型有片劑、膠囊劑、口服液、微丸等［4-7］。

中藥配方顆粒服用劑量小、儲存和攜帶方便。本研究為了優化葛根芩連配方顆粒的提取工藝，選用金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、傷寒桿菌進行抑菌藥效學實驗研究［8-11］，為工藝優化提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株 菌種金黃色葡萄球菌 (26003)、痢疾桿菌 (10104)、大腸桿菌 (44102)、綠膿桿菌 (10125)、傷寒桿菌 (50097)購自中國藥品生物制品檢定所，為微生物教研室保存菌種。

1.2 器材 試管、試管架、平皿、移液器、接種環、燒杯、三角燒瓶等 (取自來水沖洗10次，一次蒸餾水沖洗3次，二次蒸餾水沖洗3次，牛皮紙包扎，于180℃烘箱烘2 h，備用);酒精燈 (消毒用)，75%酒精、碘酊、棉球。氯化鈉注射液，南京小營制藥有限公司，批號:2005060804，規格:500 mL/瓶。

1.3 儀器設備 高壓消毒滅菌器 (上海醫療器械五廠);二氧化碳孵箱 (南京醫療器械廠)。

1.4 培養基 營養瓊脂，購于杭州微生物試劑有限公司，批號:20040512(成分:蛋白胨10 g，瓊脂17 g，牛肉浸出粉3 g，NaCl 5 g)。用法:取本品35 g加于1000 mL蒸餾水中，微微加熱至溶解，趁熱校正pH至7.4～7.6，分裝于試管中，加棉塞。于121℃、20 min高壓滅菌，冷卻后置于4℃冰箱備用。

1.5 飲片及制劑

飲片:葛根、黃芩、黃連、甘草飲片經鑒定符合《中國藥典》2010年版一部的規定。

葛根芩連配方顆粒分煎劑:稱取同批藥材，根據葛根、黃芩和炙甘草三藥合煎和黃連單煎中試工藝。葛根、黃芩和炙甘草三藥合煎加水量第一煎10倍，第二煎8倍;提取1.5 h;提取2次;提取液經濃縮、噴霧干燥得到浸膏粉。黃連單煎加水量第一煎12倍，第二煎10倍，提取1.5 h，提取2次;提取液經濃縮、噴霧干燥得到浸膏粉。將相應比例的黃連中間體浸膏粉與葛根、黃芩及炙甘草三藥合煎的浸膏粉混合均勻，得全方干燥粉，灌裝得成品［12］。取制備得到的配方顆粒適量，加水溶解超聲。

葛根芩連配方顆粒合煎劑:稱取同批藥材，根據葛根、黃芩、黃連與炙甘草四藥合煎中試工藝制備得到的配方顆粒適量，加水溶解超聲。

1.6 試驗方法

1.6.1 含藥培養基配制 以樣品配制好的待試滅菌藥液按1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16的比例加入培養基中，制成平板。

1.6.2 供試菌液制備 將各標準菌株經畫線接種培養后，挑選典型菌落接種于2 mL營養肉湯培養基。37℃培養24 h，試驗時做10－2稀釋。

1.6.3 最低抑菌質量濃度測定 將樣品配制成1.0、0.50、0.25、0.125、0.0625、0.03125 g/mL系列質量濃度，然后按比例加入培養基中，使成 0.50、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 g/mL的含藥培養基，經高壓滅菌消毒，制成含藥瓊脂平板。

取經過分光光度計測定校正過細菌濃度的待檢菌液(108CFU/mL)，以點種法用接種環分別取不同的菌液接種于含藥瓊脂表面的平板內 (每點分別接種0.05 mL金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌)，從含最低藥物濃度的瓊脂平板接種起，每個接種點的直徑約為2～3 mm，置37℃孵箱內培養24 h。培養結束后取出，觀察上述各種細菌在不同濃度的藥物平板中的生長情況。每次試驗設立對照 (培養基加菌液)。每種試驗重復3次。判斷標準:以含藥平板中細菌未生長的最低藥物濃度，為藥物對該細菌的最小抑菌濃度。

2 結果

葛根芩連配方顆粒分煎劑和合煎劑對綠膿桿菌、痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌及傷寒桿菌均有一定的抑菌作用，尤其是對金黃色葡萄球菌和傷寒桿菌。葛根芩連配方顆粒分煎劑對以上4種菌株的最低抑菌質量濃度分別為0.25000 g/mL、0.06250 g/mL、0.03125 g/mL、0.01563 g/mL，葛根芩連合煎劑的最低抑菌濃度質量分別為0.50000 g/mL、0.12500 g/mL、0.25000 g/mL、0.01563 g/mL，表明對綠膿桿菌、痢疾桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用，分煎劑強于合煎劑。結果見表1。

表1 不同提取方法制備的葛根芩連配方顆粒的MIC測定結果 (平板法)

3 討論

表1顯示，葛根、黃芩與炙甘草三藥合煎、黃連單煎制備的葛根芩連配方顆粒對綠膿桿菌、痢疾桿菌尤其是對金黃色葡萄球菌的抑菌作用顯著強于四藥合煎制備的配方顆粒。

據文獻報道，葛根芩連湯全方對埃希氏大腸桿菌抑制作用的藥物主要為黃芩與黃連［13］。黃芩、黃連對金黃色葡萄球菌的抗菌作用明顯優于痢疾桿菌，其體外抗菌強度黃連優于黃芩［14］。黃連的體外抑菌活性成分是小檗堿［15］。黃芩主要成分是黃芩苷等黃酮類成分［16］。在葛根芩連復方四藥合煎時，黃芩對小檗堿含有量的影響最大，甘草次之，葛根對小檗堿含有量也有影響，但影響最小［17］。小檗堿類生物堿呈堿性，黃酮類化合物偏酸性，因此在葛根芩連配方顆粒合煎過程中，黃連中的生物堿成分與黃芩、葛根、炙甘草中的黃酮、皂苷類成分形成沉淀，使得研究用藥液中的有效活性成分小檗堿與黃芩苷等黃酮類成分降低，從而導致抑菌作用尤其是對金黃色葡萄球菌的抑菌作用顯著下降。

根據試驗結果可知，為了保證其抑菌療效，在制備葛根芩連配方顆粒時宜采用葛根、黃芩與炙甘草三藥合煎、黃連單煎，以保證主要抑菌藥效成分小檗堿與黃芩苷等黃酮類成分的充分提取。

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