他克莫司對截肢創傷應激后大鼠肺線粒體損傷的保護作用

張海峰，張 穎，任青愛，謝曉華

（解放軍總醫院 南樓外一科，北京 100853）

當機體受到嚴重創傷、手術、休克等打擊時，會產生一系列應激反應，導致機體損傷，肺臟、心臟等遠隔臟器的損害常較為嚴重。研究發現[1]：大鼠截肢創傷可造成肺損傷，術后6h肺損傷最重。研究已證實：缺血缺氧是導致各種臟器損害的主要始動因素之一，線粒體損害是缺血缺氧損害的關鍵環節，創傷引起的缺血缺氧等原因導致線粒體結構和功能的損傷可能是創傷后肺臟等遠隔臟器損害的重要環節。本實驗旨在研究截肢創傷后大鼠肺組織細胞內線粒體結構與功能的損傷情況及他克莫司（tacrolimus，FK506）對其的干預及作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

生物氧耗分析系統（Strathkelvin，英國）、多功能酶標儀 SynergyHT（Bio-TEK，美國）；熒光分光光度計 Hitachi-2500（日立，日本）；Bradford蛋白濃度測定試劑盒 （碧云天生物技術研究所）；總ATP酶活力測定試劑盒 （南京建成生物工程研究所）；Rhodamine 123、ADP（Sigma，美國）。

1.2 實驗動物及分組

健康成年雄性SD大鼠24只，體重260～300g，購自第三軍醫大學實驗動物中心，常規條件下標準飼料喂養。隨機分為3組（n=8）。對照組：腹腔注射與干預組等體積的生理鹽水，6h后麻醉迅速處死；創傷組：以截肢創傷應激后6h大鼠作為創傷對照，創傷后立即腹腔注射與干預組等體積的生理鹽水，截肢術后6h迅速處死；干預組：截肢后立即腹腔注射FK506 0.1mg/kg[2]，截肢術后6h迅速處死。

1.3 動物模型制作及標本采集

3%異戊巴比妥鈉（80mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定。先于左側腹股溝處切開皮膚，游離出股動靜脈，結扎腹壁淺動靜脈及其他分支，于膝關節上方1.2～1.4cm處完全切斷除股靜、動脈以外的所有結構，縫扎止血，最后剪斷股靜、動脈，建立大鼠左后肢的截肢創傷應激模型。6h后將大鼠斷頭處死，立即解剖取出肺臟。取肺臟組織約1g，置于帶冰碴生理鹽水中清洗殘存血液，參照STE溶液分離法[3]提取分離肺臟線粒體：按1g組織+9ml分離介質比例加入0～4℃的線粒體分離介質 （250ml反應體系中加入蔗糖 21.935g、Tris 0.3025g、EDTA 0.073g， 用 Tris-HCl調節 pH 至7.5），組織剪碎后勻漿、離心、取上清，收集的上清液于2℃下11500g離心15min，棄上清，用適量（2～3ml）分離介質懸浮，重復離心 1次，最后將沉淀用分離介質懸浮制成線粒體混懸液。以上操作均在0～4℃下進行，1h內完成。

1.4 指標檢測

1.4.1 線粒體呼吸功能測定

采用strathkelvin氧電極法測定線粒體呼吸功能，測定參照盧國守等[4]的方法。總反應體積為800μl，反應溫度30℃。 預先加入 700μl反應介質（甘 露 醇 225mmol/L、 蔗 糖 75mmol/L、KH2PO45mmol/L、Tris 10mmol/L、K+-EDTA 0.05mmol/L、KCl 5mmol/L，pH7.4）孵育 2min，以空氣飽和，然后加入線粒體懸液100μl，預溫1～2min后依次加入反應底物谷氨酸鈉 （1.25mol/L）和蘋果酸鈉（1.25mol/L） 各 10μl， 間 隔 約 1min， 后 加 入40mmol/L的ADP 2μl，觀察線粒體呼吸態的變化，記錄氧耗曲線，計算在ADP加入后3態呼吸（ST3）和 ADP耗盡后 4態呼吸（ST4）的氧耗量，呼吸控制率（respiratory control ratio，RCR）以 3、4 態耗氧之比（ST3/ST4）表示。

1.4.2 線粒體膜電位測定

按Ronald等[5]的方法進行。反應介質為蔗糖150mmol/L、氯化鎂 5mmol/L、琥珀酸鈉 5mmol/L、魚滕酮2.5mmol/L、磷酸鉀緩沖液5mmol/L、Rhodamine123 1μmol/L、Hepes 20mmol/L，pH7.4。取線粒體懸液100μl，加反應介質1ml，室溫下反應5min，然后5000g離心5min，取上清于500nm處比色測線粒體外Rhodamine123濃度（Xout）。設定線粒體基質體積1μl/mg蛋白，線粒體內Rhodamine123 濃度 Xin=（1-1.1×Xout）×10000/蛋白濃度，線粒體膜電位 MMP=59×lgXin/Xout。

1.4.3 線粒體總ATP酶活力測定

ATP酶可分解ATP生成ADP及無機磷，測定無機磷的含量可判斷ATP酶活性的高低。定義每小時每毫克組織蛋白中ATP酶分解ATP產生1μmol無機磷的量為 1個 ATP酶活力單位［μmolPi/（mgprot·h）］。 嚴格按照 ATP 酶試劑盒說明書操作。

1.5 電鏡觀察

從創傷組、干預組中隨機留取1只大鼠肺組織約1mm×1mm×1mm，立即置于 2.5%戊二醛（磷酸緩沖液配制）中4℃固定1～2h，PBS洗3次，反復換液，1%鋨酸固定。送電鏡室浸潤包埋，制作超薄切片，透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 統計學方法

采用SPSS15軟件進行方差齊性檢驗、成組資料采用t檢驗。

2 結果

2.1 肺線粒體呼吸功能的變化

與對照組比較，創傷組肺線粒體ST3耗氧量、RCR、膜電位及總ATP酶活力顯著降低 （P＜0.05），ST4耗氧量有升高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）；與創傷組比較，干預組線粒體ST3耗氧量、RCR、膜電位及總ATP酶活力顯著升高（P＜0.05），ST4耗氧量有降低趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05） （表 1）。

表1 各組大鼠肺線粒體呼吸功能指標的變化（±s，n=8）

表1 各組大鼠肺線粒體呼吸功能指標的變化（±s，n=8）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與創傷組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

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2.2 電鏡觀察

創傷后6h肺線粒體膜結構不清晰，線粒體明顯腫脹，部分線粒體出現空泡、嵴減少、斷裂、結構不清（圖1A）。加用FK506后肺線粒體腫脹及內部結構損傷見輕度腫脹，程度比創傷組有所減輕（圖 1B）。

圖1 大鼠肺細胞線粒體形態的透射電鏡觀察

3 討論

線粒體對于維持細胞的正常功能具有十分重要的作用。研究表明，線粒體功能異常是細胞損害的關鍵環節[6]。線粒體呼吸功能ST3代表ADP對線粒體氧化磷酸化功能的刺激效應，ST4反映質子漏狀況，RCR反映線粒體結構完整性及氧化磷酸化耦聯程度；而線粒體膜電位直接反映線粒體功能[7]，線粒體其正常功能依賴于膜結構的高度完整性，線粒體能量代謝障礙會引起膜電位的下降[8]。ATP酶存在于組織細胞及細胞器的膜上，線粒體膜上的ATP酶是調節和維持細胞和線粒體鈣穩態的關鍵因素。

本實驗結果顯示：截肢創傷導致了大鼠肺線粒體結構和功能的損傷，這可能是創傷后肺損害的重要環節。這一變化可能的機制是：①氧自由基生成過量。氧自由基能夠影響線粒體呼吸鏈復合物的活力，其生成過量可通過影響線粒體的氧化磷酸化而降低細胞內ATP的合成[9]。②Ca2+超載。當Ca2+攝入過量時，促使內膜小孔開放，引起線粒體膜電位降低和氧化磷酸化的脫耦聯[10]。在心肌細胞和神經細胞的研究中顯示[11，12]：缺血后由于線粒體能量代謝障礙，導致線粒體發生腫脹；同時線粒體細胞質內Ca2+的重攝取能力下降，導致線粒體呼吸功能障礙。③線粒體通透性轉換孔的高通透狀態即所謂的線粒體通透性轉換（mitochondrial permeability transition，MPT）， 它與細胞死亡調節有關。當發生MPT時，線粒體允許分子量＜5000Da的物質自由進出，Ca2+全部釋放，膜電位完全、永久消失，線粒體腫脹，它受Ca2+、ADP、氧化應激及高PH誘導[10]。

鈣調蛋白（CaN）介導的信號通路參與血管平滑肌細胞增殖和內皮細胞功能的調節，在細胞凋亡的調節中也起重要作用。Sayen等[13]發現在CaN轉基因小鼠模型中，CaN信號通路影響了心肌線粒體的能量代謝。另有研究發現：CaN抑制劑FK506預處理可以保護心肌、肝、腎受損線粒體的呼吸功能[14，15]。本實驗結果提示FK506的應用可使肺線粒體功能明顯改善，說明CaN信號通路可能參與了截肢創傷應激后的肺線粒體損傷，FK506干預可部分改善肺線粒體的呼吸功能，對創傷應激后肺線粒體損傷具有保護作用。環孢素A （Cyclosporin A，CsA）是經典的通透性轉換孔（MPTP）抑制藥，可與親環蛋白 D（CyP-D）結合形成復合物，阻礙CyP-D與ANT的結合、抑制通道開放[16]。FK506是CsA的換代產品，可能通過相似機制抑制了通道的開放、發揮膜電位穩定作用。

總之，截肢創傷可能通過炎性反應、缺血、缺氧、Ca2+超載等途徑和機制導致肺線粒體出現結構和功能的損傷，而FK506可能通過抑制CaN信號通路、穩定線粒體膜、提高線粒體氧化磷酸化耦聯程度、在一定程度上緩解能量供應的不足，減輕創傷后肺細胞線粒體的損傷，從而為進一步研究創傷后肺損傷的保護提供了實驗依據。

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