453株血培養(yǎng)分離菌株的分布和耐藥性分析

王 靖，衣美英，賈紅兵

（中日友好醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100029）

血流感染是導(dǎo)致臨床發(fā)病和死亡的重要原因，血培養(yǎng)陽(yáng)性是確診血流感染的重要依據(jù)。隨著抗生素和免疫抑制劑的大量使用以及放療化療和介入性治療的廣泛應(yīng)用，大大增加了患者發(fā)生血流感染的可能性；血流感染的致病菌種類廣泛、耐藥性存在地區(qū)差異性；在獲得可靠的血培養(yǎng)結(jié)果前，絕大多數(shù)血流感染的最初治療為經(jīng)驗(yàn)性抗菌藥物治療，因此定期對(duì)醫(yī)院血流感染分離菌的分布和耐藥性進(jìn)行分析尤為重要[1，2]。本文通過(guò)對(duì)中日友好醫(yī)院2010年臨床血培養(yǎng)分離病原菌的分布和耐藥進(jìn)行分析，為臨床血流感染的診治和預(yù)防提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源

主要來(lái)自2010年1月～12月我院可疑血流感染的3980份血液標(biāo)本分離菌株。

1.1.2 主要試劑及儀器

哥倫比亞瓊脂、中國(guó)蘭瓊脂、M-H瓊脂（Mueller-Hinton Broth）均購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司；頭孢西丁和美洛培南紙片購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；IPM （亞胺培南）+EDTA（Ethylenediaminetetraaceticacid）（IP/IPI）Etest條購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司；BacT/Alert3D全自動(dòng)血培養(yǎng)儀和VITEK-2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏儀均購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司。

1.1.3 質(zhì)控菌株

大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌 ATCC29213、金黃色葡萄球菌ATCC43300和白色念珠菌ATCC90028，均購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705菌株由協(xié)和醫(yī)院徐英春教授惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 血培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)

將無(wú)菌采集疑似血流感染患者血液標(biāo)本注入需氧和厭氧血培養(yǎng)瓶，成人為8～10ml/瓶，兒童為4～5ml/瓶（僅做需氧血培養(yǎng)）。使用BacT/Alert3D全自動(dòng)血培養(yǎng)儀進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。血液標(biāo)本經(jīng)血培養(yǎng)儀培養(yǎng)陽(yáng)性后轉(zhuǎn)種平板，革蘭染色鏡檢。

1.2.2 鑒定及藥敏試驗(yàn)

VITEK-2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏儀對(duì)血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行菌種鑒定和藥物敏感試驗(yàn)，革蘭陽(yáng)性球菌采用慶大霉素、莫西沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、利福平、萬(wàn)古霉素、紅霉素、克林霉素、呋喃妥因、替卡拉寧、青霉素、亞胺培南、氨芐西林/舒巴坦、四環(huán)素；革蘭陰性桿菌采用慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素、頭孢吡肟、氨曲南、頭孢曲松、替卡西林/棒酸、哌拉西林/他唑巴坦、左氧氟沙星、美洛培南、亞胺培南、呋喃妥因、氨芐西林、哌拉西林。操作和結(jié)果判斷參考CLSI 2010 M100-S20。

1.2.3 頭孢西丁紙片法

檢測(cè)苯唑西林耐藥金黃色葡萄球菌（methicillin resistant staphylococcus aureus，MRSA） 及苯唑西林耐藥凝固酶陰性葡萄球菌 （methicillin resistant coagulase-negative staphylococcus，MRCNS）操作參考CLSI 2010 M100-S20。金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑≤21mm為MRSA，凝固酶陰性葡萄球菌的抑菌圈直徑≤24 mm為MRCNS。

1.2.4 改良Hodge試驗(yàn)

用生理鹽水配制0.5麥?zhǔn)系拇竽c埃希菌ATCC25922菌懸液，再用鹽水1：10稀釋，按紙片擴(kuò)散法程序接種MH平板，干燥3～10min，在平板中心放置美羅培南紙片。使用接種環(huán)挑取血瓊脂平板過(guò)夜生長(zhǎng)的3～5個(gè)試驗(yàn)菌落或質(zhì)控菌落，從紙片邊緣向外劃直線。劃線至少20～25mm。35℃培養(yǎng)16～20h，觀察MH平板，在抑菌圈與試驗(yàn)菌株或質(zhì)控菌株劃線交叉處出現(xiàn)增強(qiáng)生長(zhǎng)現(xiàn)象。若有增強(qiáng)生長(zhǎng)，則碳青霉烯酶陽(yáng)性；反之為陰性[3]。

1.2.5 EDTA （Ethylenediamin etetraaceticacid）協(xié)同試驗(yàn)

用生理鹽水配制0.5麥?zhǔn)系脑囼?yàn)菌株的菌懸液，按紙片擴(kuò)散法程序接種MH平板，干燥3～10min，在平板中心放置IP/IPI Etest條。35℃培養(yǎng)18～24h，觀察抑菌圈在IP和IPI的稀釋度，若IP/IPI≥3，則金屬酶陽(yáng)性；反之為陰性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用WHONET 5.4進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 分離菌株分布

3980份血標(biāo)本共分離出致病菌453株，陽(yáng)性率11.4%，其中革蘭陰性菌占50.4%（228/453），革蘭陽(yáng)性菌占 42.3%（192/453），真菌占5.1%（23/453），厭氧菌占2.2%（10/453）。 前 5位的致病菌依次為大腸埃希菌（130株，28.7%）、凝固酶陰性葡萄球菌 （102株，22.5%）、金黃色葡萄球菌（38株，8.4%）、肺炎克雷伯菌（26 株，5.7%）、鮑曼不動(dòng)桿菌（15株，3.4%）。

2.2 細(xì)菌耐藥性

大腸埃希菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌等主要革蘭陰性桿菌的耐藥性見(jiàn)表1。葡萄球菌耐藥性見(jiàn)表2。

2.3 MRSA及MRCNS分離率

頭孢西丁紙片法檢測(cè)38株金黃色葡萄球菌有12株MRSA，陽(yáng)性率為31.6%，102株凝固酶陰性葡萄球菌中有87株MRCNS，陽(yáng)性率為85.1%。

表1 171株革蘭陰性桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率（%）

表2 140株葡萄球菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率（%）

2.4 碳青霉烯酶耐藥分析結(jié)果

對(duì)發(fā)現(xiàn)的2株碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌，采用改良Hodge試驗(yàn)和EDTA協(xié)同試驗(yàn)進(jìn)行KPC 酶 （Klebsiella pneumoniae carbapenemase）和金屬酶檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性菌株。

3 討論

本研究分析2010年我院3980份血標(biāo)本的致病菌分離情況，分離出致病菌453株，陽(yáng)性率11.4%，與相關(guān)報(bào)道基本相似[4，5]，其中前 5位分離菌種依次為大腸埃希菌、凝固酶陰性葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌。血流感染的病原菌以革蘭陰性細(xì)菌為主，其中大腸埃希菌分離率最高，為 28.7%（130/453），這與趙碩等[6]報(bào)道血培養(yǎng)分離菌中革蘭陰性桿菌為主相同，而與徐瑗瑗等[7]報(bào)道以革蘭陽(yáng)性球菌為主有所不同，表明存在明顯的地區(qū)差異性。192株革蘭陽(yáng)性分離菌中，葡萄球菌占72.9%（140/192），其中凝固酶陰性葡萄球菌占72.8%（102/140）、金黃色葡萄球菌占27.2%（38/140）。凝固酶陰性葡萄球菌多為皮膚表面正常菌，隨著介入性操作的廣泛應(yīng)用和免疫抑制劑的大量使用，其已成為醫(yī)院血流感染的一種重要病原菌[5]。另外，存在一定比例的真菌或厭氧菌引起的血流感染。

由于臨床大量使用頭孢菌素類、碳青霉烯類和氟喹諾酮類等藥物，出現(xiàn)多種院內(nèi)感染多重耐藥流行株，其感染住院患者后引起血流感染直接導(dǎo)致血培養(yǎng)分離菌株表現(xiàn)為多重耐藥。2010年我院血流感染分離前5位致病菌的耐藥分析表明，分離菌株對(duì)多種抗菌藥物耐藥明顯，大腸埃希菌對(duì)亞胺培南和美洛培南較敏感，美洛西林、氨芐西林、哌拉西林耐藥率均較高，發(fā)現(xiàn)2株對(duì)亞胺培南和美洛培南耐藥的肺炎克雷伯菌，改良Hodge試驗(yàn)和EDTA協(xié)同試驗(yàn)均為陰性，提示可能存在其它耐藥機(jī)制，需進(jìn)一步深入研究。多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)絕大多數(shù)抗菌藥物耐藥，其中碳青霉烯耐藥率達(dá)71.6%，僅米諾環(huán)素具有較高的敏感性。葡萄球菌對(duì)青霉素耐藥率＞95.5%，MRSA陽(yáng)性率為31.6%，MRCNS陽(yáng)性率為85.1%，凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、克林霉素的耐藥率明顯高于金黃色葡萄球菌，對(duì)慶大霉素、利福平、呋喃妥因的耐藥率則低于金黃色葡萄球菌，未發(fā)現(xiàn)耐萬(wàn)古霉素和替考拉寧的葡萄球菌。

血流感染是引起患者死亡的主要原因之一，及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷對(duì)血流感染的治療和患者預(yù)后至關(guān)重要。患者臨床癥狀和體征有助于疑似血流感染病例的診斷，但特異性差，目前血培養(yǎng)是診斷血流感染的金標(biāo)準(zhǔn)。由于血培養(yǎng)檢測(cè)周期長(zhǎng)，早期對(duì)疑似血流感染患者的治療主要是以經(jīng)驗(yàn)性抗菌藥物治療為主，而且血流感染的致病菌種類多、耐藥性存在地區(qū)差異性，定期對(duì)本地區(qū)或醫(yī)院的血培養(yǎng)分離菌株的分布和耐藥性進(jìn)行回顧性分析，指導(dǎo)臨床合理選擇抗菌藥物尤為重要。

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[3]CLSI.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing twentieth informational supplement[S].M100-S20，2010，30（1）：46-51.

[4]張淑青，王賀永，李宏芬，等.血培養(yǎng)標(biāo)本中病原菌的分布及藥敏分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21（7）：1472-1474.

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[7]徐瑗瑗，徐少寶，熊自忠，等.2003～2009年血標(biāo)本分離病原菌分布及其藥敏分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21（10）：2103-2105.