雞傳染性支氣管炎病毒分離株與疫苗株抗原相關性和S1基因序列分析

任海松，張秀美，崔言順，許傳田，楊少華，李建亮，胡北俠*

(1.山東農業大學動物科技學院，山東泰安 271018;2.山東農科院畜牧獸醫研究所;3.山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東 濟南 250100)

雞傳染性支氣管炎是由(Infectious bronchitious，IB)雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitious-Virus，IBV)引起的一種急性、高度接觸性傳染性疾病。該病原是冠狀病毒科、冠狀病毒屬第三抗原群的代表種［1］。是我國規定的禽類二類傳染病之一。本病能夠在雞的呼吸道、消化道、腎臟、輸卵管、腺胃等多個部位復制，能夠導致雞群生產效益的大幅度下降，所造成的損失往往遠遠大于直接死亡引起的損失，給養雞業帶來巨大的危害［2］。

S1基因是IBV的主要免疫原基因，S1蛋白與病毒的免疫保護性有關，并且S1蛋白能夠誘導機體產生病毒的中和抗體、血凝抑制抗體及細胞介導的免疫應答［3，4］反應等。與病毒的抗原性和血清型有重要的關系。血清中和試驗(VN)是一種區別不同血清型差別的最敏感的方法［5，6］。本實驗通過雞胚交叉中和試驗8株山東省分離株進行血清學分型，并結合S1基因序列分析，探討兩者之間的關系，旨在為臨床疫苗應用和病毒防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病毒分離與鑒定

對疑似IBV的病料按常規方法處理后接種9－11日齡SPF雞胚，37℃培養，觀察雞胚病變，并通過新城疫病毒干擾試驗，RT－PCR等方法對病毒進行鑒定。8個IBV分離株的背景資料及基因序列GenBank登錄號見表1。

1.2 引物、菌種、質粒和試劑

S1基因引物序列參考文獻［6］，由上海生物工程有限公司合成。p EASY－T1 載體，購自北京全式金公司。PrimeScript TM One Step RT－PCR Kit、Trizol和Gel Ext raction Kit，均購自大連寶生物工程有限公司。DH5α菌種為本實驗室保存。

1.3 病毒增殖及RNA的提取

將IBV分離株分別接種9－11日齡的SPF雞胚，37℃培養72 h后(棄去24 h內死亡的雞胚)無菌收集尿囊液，離心后，按TRIzol試劑(Invitrogen)說明書提取病毒基因組RNA。

1.4 IBV分離株S1基因擴增、克隆測序以及核苷酸序列的比較分析

應用RT－PCR 方法擴增S1基因，將回收后的PCR 產物與pMD18－T 載體進行連接反應后，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞。經菌液PCR 初步鑒定后，委托北京六和華大基因科技股份有限公司測序。利用lasergene7.0生物軟件，將IBV分離株S1基因分別與GenBank中參考株S1基因核苷酸序列及推導的氨基酸序列進行同源性比較和系統進化分析。

表1 山東省商業雞群中分離的8株IBV分離株的分離背景Table 1 Eight IBV strains isolated from commercial flocks in Shandong province of China

1.5 IBV疫苗株(491和H120)和分離株陽性血清的制備

［7］方法，用SPF雞分別制備IBV疫苗株(491，H120)和分離株的陽性血清。

1.6 IBV雞胚半數感染量(EID50)的測定

將IBV分離株和疫苗株用0.01 M PBS緩沖液(PH7.2)進行10倍倍比稀釋，取10－4～10－85個稀釋度分別接種9～11日齡SPF雞胚5枚，0.2 mL/胚，37℃孵育至18日齡，每日照胚2次，棄去24 h內死亡雞胚，根據雞胚死亡及病變情況，按Reed–Muench法計算EID50［8］。

1.7 雞胚中和試驗

參考文獻［9］方法，采用固定病毒稀釋血清的方法，陽性血清進行2倍倍比比稀釋，每個稀釋度分別與等體積200EID50的病毒液混勻，室溫作用60 min后接種9～11日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚，每稀釋度接種5枚，置37℃培養至18日齡，棄去24 h內死亡雞胚，根據雞胚死亡及病變進行結果判定，以能使50%以上雞胚保護的血清最高稀釋倍數為血清的中和效價。抗原相關性的計算按免疫學方法進行:相關系數(R)源血清效價1/同源血清效價1，r2=異源血清效價2/同源血清效價2［10］。R＞80%時為同一血清型，R在25%和80%之間為同一血清型的不同亞型，R≤25%時為不同血清型。

2 結果

2.1 S1基因序列測定結果以及與參考株遺傳進化分析

8個IBV分離株S1基因序列測定結果顯示:其中6個IBV分離株S1基因ORF長度為1620個bp，分別編碼540個氨基酸(包括蛋白酶裂解位點);分離株SDTA06111S1基因ORF長度為1611個bp，編碼537個氨基酸;CK/CH/SD09/005毒株S1基因ORF長度為1640個bp，編碼546個氨基酸;8個分離株之間S1基因核苷酸序列及其推導的氨基酸序列的同源性分別為65.6% ～99.6%和61.0% ～99.1%;與參考毒株核苷酸序列以及推導的氨基酸序列的同源性分別介于62.4% ～99.4%和51.9% ～98.7%。8個分離株與疫苗株H120和491核苷酸序列同源性分別介于:65.5% ～99.3%和78.2% ～78.5%(見表3);以疫苗株H120為參考，發現8個IBV分離株S1基因存在廣泛的基因突變和氨基酸替代現象，其中分離株CK/CK/SD09/005在98－99(G)、142－143(S)、288－289(QKEP)，375－376(S)位核苷酸處共插入了7個氨基酸(圖略)。

圖1 8個IBV分離株與參考毒株S1基因遺傳進化樹Fig.1 Phylogenetic tree generated from the nucleotide sequences of the S1 genes of published IBV strains obtained from GenBank and eight IBV isolates

根據S1基因核苷酸序列繪制的遺傳進化樹顯示(圖1):8個IBV分離株(下劃線為分離株)和26個參考毒株形成4個進化群。其中SDTA0611與H120等在內的21個分離株構成了基因I群，491、UK793和J2組成基因II群;包括SDLY0612在內的6個分離株與三個參考毒株構成基因III群，分離株CK/CH/SD09/005和參考株TC07－2(GQ265948，中國廣東分離株)形成獨立的第IV基因群。

2.2 雞胚交叉中和試驗

IBV疫苗株H120、491和8個分離株雞胚交叉中和試驗結果見表2。從表2可見，疫苗株H120和491不能交叉中和，說明二者分屬不同的血清型;疫苗株陽性血清對IBV分離株的中和試驗結果表明:8個分離株中有6個分離株(分別是S1，S2，S3，S4，S7和S8)可以被H120陽性血清中和，3個分離株可以同時被H120和491陽性血清中和(分別是S3，S7和S8)，2個分離株(S5和S6)不能被H120或491陽性血清中和。8個IBV分離株陽性血清對H120和491的中和試驗結果是:H120可以被5個分離株陽性血清中和(S1，S2，S3，S4和S8)，491可以被除S6之外的7個分離株陽性血清中和。疫苗株和8個分離株之間交叉中和試驗結果顯示:H120和5個分離株(S1、S2、S3、S4和S8)之間具有雙向交叉中和反應，與S7僅有單向交叉中和作用;491和3個分離株(S3、S7和S8)之間具有雙向交叉中和反應，與4個分離株(S1、S2、S4和S5)之間僅有單向交叉中和反應。

表2 IBV分離株與疫苗株491，H120的中和價Table 2 Neutralization titers between IBV isolates and 491，H120

2.3 分離株與疫苗株的抗原相關系數

表3 IBV分離株和疫苗株491，H120的抗原相關系數Table 3 Antigenic relatedness values(R)and S1 gene nucleotide identity between IBV isolates and 491，H120 strains

3 討論

S1基因作為重要的免疫原基因，并具有高度的變異性。S1基因遺傳進化分析顯示，8個分離株中6個毒株與常用疫苗株H120、MA5和491遺傳距離較遠，形成獨立的基因III群，也是目前山東省IBV的主要基因型。S1基因同源性分析結果表明，分離株與H120和491的同源性分別在65.5% ～99.3%和65.4% ～78.5%之間;以H120為參考株，多數分離株都存在著氨基酸的插入現象，其中CK/CK/SD09/005在98－99(G)、142－143(S)、288－289(QKEP)，375－376(S)位核苷酸處共插入了7個氨基酸，由于廣泛的基因突變和多個氨基酸的插入，分離株CK/CK/SD09/005除與TC07－2同源性較高(98.7%)外，與Gen-Bank上登錄的IBV序列同源性均低于70%。此外，CK/CK/SD09/005與H120和491的S1基因同源性分別為65.5%和65.4%，抗原相關系數分別為18%和9%，因此推測CK/CK/SD09/005可能源自疫苗株和野毒株之間的基因重組。

雞胚中和試驗和抗原相關系數計算結果發現:IBV疫苗株和部分分離株之間僅能發生單向中和試驗或能夠雙向交叉中和的毒株之間抗原相關系數小于25%(屬于不同血清型)，說明IBV存在多個中和性抗原表位，可以通過部分中和表位的改變產生新的血清型。8個IBV分離株中，僅有SDWF0608、SDLY0612、SDLY0701三個分離株與疫苗株H120同屬Mass血清型的不同亞型，其它5個分離株與H120和491屬于不同的血清型，抗原相關性均低于25%，本研究結果從體液免疫的角度解釋了臨床上雞群免疫H120或491疫苗后仍然經常發生IBV感染的原因，也提示山東省目前IBV流行株存在多個血清型，必須在全面鑒定這些流行株血清型的基礎上進行多價疫苗的研制。

結合S1基因序列同源性和抗原相關性結果(表3)發現分離株SDTA06111與H120同屬基因I群，且S1基因核苷酸序列的同源性分別達到99.3%，但是二者抗原相關系數僅18%，不屬于同一個血清型;分離株SDLY0612與H120的抗原相關系數最高(70.71%)，但是兩者S1基因序列的同源性僅78.2%，說明S1基因同源性和血清型沒有明顯的相關性，IBV可能通過少數基因突變導致中和性抗原表位的改變，從而產生新的血清型。

綜上所述，由于IBV基因突變、插入、缺失和重組并不斷產生新的血清型，導致生產上疫苗免疫失敗，必須加強對IBV流行株的監測，并采取包括生物安全在內的各項綜合防控措施才能有效預防IB的發生。

參考文獻

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