懸鈴木SSR反應(yīng)體系建立及引物篩選

劉榮寧，趙曉改，趙振利，范國強(qiáng)*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450002;2.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 中牟 451450)

懸鈴木具有耐修剪整形、生長迅速、隔離噪音、抗煙和抗塵的能力，特別對(duì)SO2、Cl2等有毒氣體有較強(qiáng)的抗性，對(duì)城市環(huán)境有極強(qiáng)的適應(yīng)能力，且有“行道樹之王”的美稱，故世界各國廣為種植［1］。SSR標(biāo)記技術(shù)目前已廣泛用于基因定位、遺傳作圖、多態(tài)性分析、構(gòu)建DNA指紋圖譜等［1－7］各個(gè)領(lǐng)域。SSR標(biāo)記雖具有試驗(yàn)程序簡單、物種及染色體組特異性等優(yōu)點(diǎn)，但因其擴(kuò)增過程中有諸多因素的影響，也會(huì)產(chǎn)生非特異擴(kuò)增等問題，從而給研究工作帶來不便。目前，SSR 技術(shù)已在水稻［9］、玉米［10］、柑橘［11］、櫻桃李［12］、泡桐［13］等標(biāo)記研究中得以應(yīng)用，但尚未見到有關(guān)懸鈴木SSR體系建立的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在通過篩選反應(yīng)體系中各因素的最佳組合，并進(jìn)行引物篩選檢驗(yàn)，建立一套適合懸鈴木基因組SSR－PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，并為基因定位及克隆研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)泡桐研究所林木生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室在溫度(25±2)℃，光強(qiáng)130 μmol·m－2·s－1，光照時(shí)間16 h·d－1的條件下，培養(yǎng)35 d的三球懸鈴木(Platanus orientalis L.)健康組培苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 懸鈴木基因組DNA的提取 取35 d組培苗的葉片，參照TIANGEN試劑盒說明書提取懸鈴木基因組DNA，利用紫外分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳法檢測所提取的DNA濃度和質(zhì)量，置－20 ℃冰箱保存，用于PCR擴(kuò)增。

1.2.2 SSR－PCR反應(yīng)程序設(shè)定 SSR擴(kuò)增程序:SSR－PCR擴(kuò)增在Biometra擴(kuò)增儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序參照曹喜兵等［13］方法。

1.2.3 SSR－PCR基本反應(yīng)體系 參照曹喜兵等［13］SSR反應(yīng)體系建立。對(duì)影響PCR擴(kuò)增結(jié)果的退火溫度、dNTP和引物(5'GCC AGC GAA CTC AAA TCT與3'AAC GAG AAC GAC GAG CG)濃度，Taq酶用量，模板DNA濃度等參數(shù)進(jìn)行梯度試驗(yàn)(表1)。當(dāng)利用一種參數(shù)試驗(yàn)時(shí)，其它參數(shù)保持不變，以便篩選出5種參數(shù)的最佳組合，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

表1 PCR 反應(yīng)體系中處理因素和水平Table 1 Factor and level of PCR reaction system

1.2.4 PCR產(chǎn)物的電泳及分析 PCR產(chǎn)物采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。20 μL PCR產(chǎn)物與5.5 μL 加樣緩沖液(49 mL 甲酰胺、1 mL 0.5 mol·L EDTA、0.125 g溴酚藍(lán)、0.125 g 二甲苯菁)混合，在95℃變性5 min后，放入4 ℃冰箱冷卻待用。電泳時(shí)，每泳道上樣量為5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳條件為60 W恒功率，電泳時(shí)間為30 min。電泳結(jié)束后，凝膠固定、銀染、顯影，并用UMAX PowerLook2100LX型掃描儀掃描凝膠。

1.2.5 引物篩選 參考常莉［14］從其它木本植物篩選出的417對(duì)微衛(wèi)星引物，由鄭州寶賽生物科技有限公司合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 懸鈴木SSR分子標(biāo)記反應(yīng)體系

2.1.1 不同退火溫度對(duì)懸鈴木SSR－PCR反應(yīng)程序的影響 退火溫度對(duì)SSR－PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖1)可看出，不同退火溫度對(duì)懸鈴木SSR－PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量影響不同。當(dāng)退火溫度為45、47、50℃時(shí)，SSR－PCR擴(kuò)增出的條帶亮度逐漸明顯增強(qiáng);當(dāng)退火溫度為53、55、57℃時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶逐漸減弱。當(dāng)SSRPCR擴(kuò)增引物一定時(shí)，懸鈴木擴(kuò)增產(chǎn)物量隨退火溫度逐漸升高而增大，但當(dāng)退火達(dá)到一定溫度時(shí)，SSRPCR擴(kuò)增量又隨其溫度的增高而下降，因此該研究認(rèn)為針對(duì)引物對(duì)ORNL－97適宜的退火溫度選擇為50℃。同時(shí)針對(duì)不同的引物在進(jìn)行SSR－PCR反應(yīng)程序時(shí)可根據(jù)引物所標(biāo)出的退火溫度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，才能達(dá)到理想的效果。

2.1.2 不同dNTP濃度對(duì)懸鈴木SSR－PCR擴(kuò)增的影響 不同dNTP濃度對(duì)懸鈴木SSR擴(kuò)增產(chǎn)物量產(chǎn)生了明顯的影響。當(dāng) dNTP 濃度分別為0.025、0.05、0.1 和 0.2 mmol·L－1(泳道 1 －4)時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后均有譜帶出現(xiàn)，但不同dNTP濃度擴(kuò)增譜帶的亮度強(qiáng)度存在著差異。其中，0.2 mmol·L－1擴(kuò)增出的譜帶亮度最強(qiáng)，0.1 mmol·L－1次之，0.05 mmol·L－1較弱，0.025 mmol·L－1最弱。當(dāng) dNTP 濃度為0.3 和0.4 mmol·L－1時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后逐漸減弱(泳道5和6)。意味著dNTP濃度過低降低SSR－PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量，濃度過高又會(huì)抑制產(chǎn)物產(chǎn)生，本試驗(yàn)中，dNTP濃度為0.2 mmol·L－1時(shí)，SSR－PCR擴(kuò)增的譜帶最清晰，故選擇0.2 mmol·L－1作為懸鈴木SSR－PCR擴(kuò)增的最適濃度。

2.1.3 引物濃度對(duì)SSR－PCR擴(kuò)增的影響 由引物濃度對(duì)SSR－PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖3)可以看出，雖然不同引物濃度對(duì)SSR擴(kuò)增產(chǎn)物量的影響不同，但是試驗(yàn)設(shè)置的6個(gè)濃度均可擴(kuò)增出電泳譜帶。當(dāng)引物濃度為 0.1、0.2 和0.4 μmol·L－1時(shí)，擴(kuò)增出的譜帶明顯增強(qiáng)(泳道 2、3 和 4)，當(dāng)濃度分別 0.6 μmol·L－1時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果最清楚，故選擇0.6 μmol·L－1作為懸鈴木SSR－PCR擴(kuò)增的最適濃度。

2.1.4 懸鈴木DNA濃度對(duì)SSR擴(kuò)增的影響 不同濃度懸鈴木DNA的SSR－PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖4)表明，當(dāng)懸鈴木DNA為0.5ng·μL－1時(shí)，譜帶亮度過低(泳道1)，在一定范圍內(nèi)模板DNA濃度對(duì)泡桐SSR擴(kuò)增結(jié)果影響不顯著。雖然懸鈴木DNA濃度由1.0升高到16.0 ng·μL－1，但其SSR擴(kuò)增出的電泳譜帶亮度差異不大。因此，從擴(kuò)增產(chǎn)物的穩(wěn)定性和節(jié)省模板用量等方面考慮，我們選擇4.0 ng·μL－1懸鈴木DNA作為其SSR－PCR擴(kuò)增體系的適宜模板濃度。

2.1.5 Taq酶量對(duì)SSR擴(kuò)增的影響 由不同Taq酶量對(duì)SSR－PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖5)的影響可以看出，不同Taq酶量對(duì)泡桐SSR擴(kuò)增產(chǎn)物量產(chǎn)生了較為顯著的影響。在SSR－PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中，在一定范圍內(nèi)隨著Taq酶量的逐漸增加，其擴(kuò)增產(chǎn)物量也逐漸增大，之后，隨著Taq酶量的增加，譜帶亮度和清晰度逐漸降低。在SSR－PCR擴(kuò)增體系中，我們選用0.05U·μL－1為懸鈴木SSR－PCR擴(kuò)增體系的最適Taq酶量。

2.2 引物篩選

根據(jù)上述優(yōu)化體系，從其它木本植物的417對(duì)SSR引物中篩選出適合懸鈴木SSR擴(kuò)增的54對(duì)引物(表2)。結(jié)果表明，選出的54對(duì)引物，所擴(kuò)增的譜帶清晰、分辨率高、重現(xiàn)性好、多態(tài)性強(qiáng)，是較適宜的擴(kuò)增體系(圖6)。

表2 懸鈴木SSR擴(kuò)增引物Table 2 Primers used in the SSR－PCR of the plant

引物編號(hào)Primer Codes核苷酸序列(5’－－－3’)Nucleotide sequences(5’－ － －3’)備注References引物編號(hào)Primer Codes核苷酸序列(5’－－－3’)Nucleotide sequences(5’－ － －3’)備注References 19 CGG AGG GTG TGC TGC CGA AGGCC CAG CCC ATA TCT GCT ［18］ 46 TTC ATC CTA GCT GCT TGC TTTCTC AGC GTC TAC CCC ATC AA ［23］20 TAT TTC TAC AAC ATA CCA AAA CGCAT TAC TCA AGC ACA TGC ACG C ［23］ 47 CTT GTT GCT GCT TCT GCAAC AAA ATA ATA TAA ATG CTC TGC ［23］21 CAT CCA TGA TAT CAA ACC AAA TTA GTGT AAT CCA AAC ATA AAA TCC CAA G ［23］ 48 CAC GGC CCT TAG CTT TAC CTTTTC TGA TGG GGC AAC TG ［23］22 ACC TCA ATC ATC ATC ACC ATC TTGCG CTG AAA TGA TCA TAA TGT AG ［23］ 49 TTG GGC GCC TCT TGC TCG TCT TCAAGC ATG CGT GGT GGT CTC GTC AGC ［23］23 TGT ATC CCC TCC TCG GAT AAGGC ATT AAT GGA TGA TGA TGA ［24］ 50 AGG CCG AGC AAG ATG ACG ACG ATACGT TCG ACA GCG GCT CTT CAA AAG ［23］，24 AAT TAA CTC CAA CAG CTC CAATG GTT GCT TAA TTC AAT GG ［24］ 51 GAC GAC ATG ACG AGG GAG GAAGCA CTA TGG GCG CAC TAC ACA ［23］，25 AAG CAA AGT CCA TAA AAA CGCGGA CGA AGA CGC TCC ATT ［25］ 52 CCT GCA AGG GTA TTT GGG TTT ACGTTC GTT GGC CCC AAA TAC TTC AAT ［23］，26 TGC AGG TGA TGT CAT CAC CGAAC CGA ATC CAT GCG TCA CC ［23］ 53 ATT TAG TTA TGA TCT GGT TTT TAAG CTA TTA TAA TCA TTT CTC ACA ［23］，27 ACG TAT ATG AAG TTC TTG ATT GCGAC AGA TCA TTA TGA TTA CTA CAG ［23］ 54 TTT GGC AAA AGA ACA TTG AGA TATA TTG GTA TTA GTT GAA GTT ［23］，

圖6 懸鈴木54對(duì)引物的SSR擴(kuò)增圖Fig.6 Gel electrophoresis of the SSR products with 54 pairs of the plant

3 結(jié)論與討論

SSR－PCR標(biāo)記具有多態(tài)性高、試驗(yàn)重復(fù)性好和共顯性遺傳的特點(diǎn)，雖然廣泛用于農(nóng)作物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、植物分類和進(jìn)化及遺傳多樣性［2－13］等方面，但對(duì)于不同植物SSR標(biāo)記的技術(shù)體系有所不同。該試驗(yàn)采用了先構(gòu)建基本反應(yīng)體系，再在基本反應(yīng)體系中進(jìn)行單因素梯度優(yōu)化試驗(yàn)的方法，既節(jié)約了成本，又有的放矢的針對(duì)每一個(gè)因素。本實(shí)驗(yàn)對(duì)影響SSR擴(kuò)增效果的退火溫度等5個(gè)參數(shù)的篩選，建立的最適懸鈴木SSR－PCR擴(kuò)增體系為，20 μL的反應(yīng)體系中，包括懸鈴木4.0ng·μL－1DNA，0.2 mmol·L－1dNTP，0.6μmol·L－1引物，0.05 U·μL－1Taq 酶，退火溫度為 50 ℃。

影響PCR擴(kuò)增效果的因素多種多樣，引物退火溫度就是其中之一［1－14］。在利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)開展新植物DNA堿基序列變化研究中，需要進(jìn)行大量的引物篩選工作。雖然每對(duì)引物都有其理論的退火溫度，但是適宜的理論退火溫度不能得到理想的擴(kuò)增效果。通用SSR－PCR擴(kuò)增需要對(duì)每一對(duì)引物進(jìn)行適宜退火溫度的篩選［1－14，16］，工作單調(diào)而繁重。因此，本試驗(yàn)采用TD－PCR技術(shù)建立起來的懸鈴木SSR－PCR分子標(biāo)記反應(yīng)體系可以在懸鈴木相關(guān)研究中兼顧大部分引物對(duì)退火溫度的要求，使引物篩選工作能夠快速準(zhǔn)確的進(jìn)行，從而避免煩瑣引物退火溫度的篩選工作。至于該反應(yīng)體系在懸鈴木現(xiàn)代生物技術(shù)研究中的應(yīng)用情況將在后續(xù)的論文內(nèi)給予報(bào)道。

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