茶多酚對哮喘大鼠氣道炎癥和氣道重塑的干預研究*

楊 青 王 堯 李里香 況九龍

支氣管哮喘（哮喘）是我國常見病之一。臨床上對于輕中度哮喘常規用激素治療，療效確切，但對于難治性、重癥哮喘或皮質激素抵抗型哮喘，激素治療效果不甚理想。對于哮喘氣道重塑發病機制至今仍不十分清楚，其中氧化/抗氧化失衡學說是近年來討論的熱點，即認為哮喘是由于機體活性氧增多、脂質過氧化增強和（或）抗氧化能力降低，最終導致氧化/抗氧化失衡[1]。持續反復引起肺損傷，從而進一步加重哮喘發作。茶多酚（tea polyphenols，TP）是從茶葉中提取的一種純天然抗氧化藥物，主要成分是4個含有兒茶素的單體，通過提供大量羥基來清除氧自由基，具有強抗氧化、抗突變、抗癌變、抗菌、抗病毒等多種生物學功能[2]。本實驗通過研究茶多酚對支氣管哮喘大鼠早期及晚期氣道炎癥、氣道重塑與氧化應激水平的干預及影響，并探討哮喘氣道重塑發生的可能機制，以指導臨床用藥。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原菌級別雌性SD大鼠48只，4～6周齡，體質量（160±10）g，購自南昌大學醫學實驗動物中心。在溫度為（25±1）℃的飼養室中群居飼養，提供充足的食物和水源。所有動物在開始實驗前至少飼養1周以適應環境。

1.2 主要試劑和儀器 HE病理染色試劑盒、Masson病理染色試劑盒、PAS病理染色試劑盒購自珠海貝索生物技術有限公司；轉化生長因子（TGF）-β1成套免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程公司；大鼠TGF-β1 ELISA試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；茶多酚購自四川樂山禹伽茶業科技開發有限公司 （批號：TP-050801）。圖像采集系統、采集軟件（日本OLYMPUS公司）；ImagePro-plus 6.0真彩色醫學圖像分析軟件（德國Leica公司）。

1.3 哮喘模型的制備 48只大鼠按隨機數字表法分成對照組、哮喘組、早BUD組、早TP組、晚BUD組、晚TP組，每組8只。除對照組外，其他各組均進行哮喘模型的制備。參照Palmans等[3-4]的方法并稍做改進：在造模第1天、第8天各注射卵蛋白（OVA）混懸液1 mL；對照組用1 mL生理鹽水代替。致敏2周（造模15 d）后霧化吸入OVA，每次霧化約30 min，隔日1次，對照組用生理鹽水霧化。以大鼠出現煩躁、搔鼻、呼吸加快、口唇發紺、腹肌痙攣、點頭呼吸及四肢癱軟等表現為激發成功。

1.4 給藥方法 早BUD組：在造模前2周，開始霧化0.02%布地奈德，每次20 min，每日1次。在造模時期，于霧化1%OVA前2 h時開始霧化布地奈德，方法同前。晚BUD組：在造模5周后，于霧化1%OVA前2 h開始霧化0.02%布地奈德，每次20 min，每日1次。早TP組：在造模前2周，開始茶多酚灌胃[400 mg/（kg·d）]，每日 1 次。 在造模時期，于霧化1%OVA前2 h時開始茶多酚灌胃，方法同前。晚TP組：在造模5周后，于霧化1%OVA前2 h時開始茶多酚灌胃[400 mg/（kg·d）]，每日 1 次。各組均干預至造模后 12 周。哮喘組除造模時用的OVA外不用其他藥物干預。對照組僅予等量生理鹽水。

1.5 肺組織病理切片、染色、分析 右肺中葉用4%中性多聚甲醛固定，常規石蠟包埋和切片，片厚3 μm，分別行HE染色、Masson染色、PAS染色和免疫組化染色。采用Img-Pro 6.0圖像分析系統，每張切片在400倍顯微鏡下，確定5個完整支氣管橫截面，分別測取其支氣管基底膜內壁周徑(Pbm)、平滑肌面積（WAm）、膠原沉積面積（Wcol），并用Pbm將測量值標化，分別以WAm/Pbm和Wcol/Pbm代表相應管壁層的厚度，每個支氣管各測5次，取其均值。測定TGF-β1免疫組化染色切片的積分光密度（IOD）值，每張切片隨機讀取10個視野測定IOD值，取平均值。

1.6 肺組織TGF-β1含量測定及氧化應激水平測定 采用ABC-ELISA測定肺組織中TGF-β1含量。采用TBA法測定MDA含量，用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力。操作按試劑盒內說明書進行。

2 結果

2.1 大鼠肺組織病理改變 （1）HE染色顯示，哮喘組與對照組相比，支氣管壁、間隔及血管周圍有大量炎性細胞浸潤，管腔明顯變窄。早BUD組上述變化較哮喘組改善，晚BUD組改善不明顯。（2）PAS染色顯示，與早TP組相比，哮喘組支氣管上皮杯狀細胞明顯增加，氣道內黏液分泌旺盛。（3）Masson染色顯示，晚TP組支氣管壁周圍平滑肌細胞核呈深棕色、細胞漿呈紅色，膠原纖維呈藍色。晚BUD組平滑肌增生、肥大明顯，氣道上皮下膠原沉積明顯增多。（4）TGF-β1免疫組化染色結果顯示，哮喘組TGF-β1廣泛表達，主要表達在氣道黏膜上皮層，平滑肌、炎性細胞、細胞間質也有表達。晚TP組TGF-β1表達減少，見圖1。

2.2 各組間WAm/Pbm、Wcol/Pbm及TGF-β1的比較 對照組、早BUD組、早TP組和晚TP組WAm/Pbm、Wcol/Pbm及TGF-β1均低于哮喘組，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。早BUD組與早TP組、晚BUD組與哮喘組之間上述指標比較差異均無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.3 各組肺組織TGF-β1、MDA含量及SOD活性的比較 對照組、早TP組、早BUD組和晚TP組的MDA含量和TGF-β1的含量均低于哮喘組，SOD活性高于哮喘組，差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。早BUD組與早TP組、晚BUD組與哮喘組的上述指標比較差異均無統計學意義 （P>0.05），見表2。

Figure 1 Pathological sections of airway wall in different groups圖1 各組氣道壁病理切片

2.4 相關性分析 肺組織MDA含量與SOD活性呈負相關 （r=-0.573，P<0.01）。 TGF-β1 含量與MDA 含量呈正相關（r=0.458，P<0.01）。

Table 1 Comparison of lung pathological sections between different rat groups表1 各組大鼠肺組織病理切片比較±s）

Table 1 Comparison of lung pathological sections between different rat groups表1 各組大鼠肺組織病理切片比較±s）

*P<0.05，**P<0.01

對照組（1）哮喘組（2）早 BUD 組（3）早 TP 組（4）晚 BUD 組（5）晚 TP 組（6）F q（1）∶（2）（2）∶（3）（2）∶（4）（2）∶（5）（2）∶（6）（3）∶（4）888888 WAm/Pbm（μm）3.68±0.46 8.72±1.58 4.63±0.83 4.84±0.92 8.09±1.25 7.01±1.07 29.33**13.24**10.75**10.20**1.66 4.49*0.55 Wcol/Pbm（μm）4.20±1.75 17.98±6.67 5.01±1.00 5.07±1.03 16.46±3.32 12.82±2.33 28.32**11.75**10.98**11.00**1.30 4.40*0.03 TGF-β1（IOD 值）1.28±0.31 10.42±2.88 2.26±0.63 2.36±0.91 9.73±2.12 8.07±1.64 49.52**15.45**13.79**13.62**1.17 3.97*0.17組別 n

Table 2 Comparison of contents of MDA,SOD and TGF-β1 in lung tissues between different rat groups表 2 各組大鼠肺組織中MDA、SOD 、TGF-β1的水平比較±s）

Table 2 Comparison of contents of MDA,SOD and TGF-β1 in lung tissues between different rat groups表 2 各組大鼠肺組織中MDA、SOD 、TGF-β1的水平比較±s）

*P<0.05，**P<0.01

對照組（1）哮喘組（2）早 BUD 組（3）早 TP 組（4）晚 BUD 組（5）晚 TP 組（6）F q（1）∶（2）（2）∶（3）（2）∶（4）（2）∶（5）（2）∶（6）（3）∶（4）888888 MDA（μmol/g）5.67±1.09 12.81±3.32 6.97±1.32 6.88±1.28 10.84±2.47 8.71±1.62 17.40**10.03**8.96**9.10**2.02 6.29*0.14 SOD（U/mg）129.65±7.16 94.39±5.37 123.27±8.77 124.00±7.68 110.68±6.30 114.64±6.56 25.72**14.13**11.58**11.87**2.53 8.12*0.29 TGF-β1（mg/L）48.21±9.38 128.32±16.24 56.46±9.87 58.42±10.34 118.12±13.42 103.21±12.87 65.77**18.48**16.58**16.13**2.35 5.79*0.45組別 n

3 討論

支氣管哮喘的基本特征為氣道慢性炎癥、氣道高反應性和氣道重塑[5]。氧化應激上調了Th2介導的炎癥反應，增加了支氣管高反應性，促使了氣道重塑的形成[6]。SOD作為體內重要的抗氧化酶，其活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力。MDA是脂質過氧化反應的產物，其水平高低間接反映了細胞受自由基攻擊的嚴重程度。本研究結果顯示，哮喘肺組織中MDA含量升高，SOD活力明顯下降，經藥物干預后，氧化應激水平下降，以早TP組、早BUD組明顯，晚TP組次之，晚BUD組無明顯改善。

目前哮喘治療指南強調吸入激素控制哮喘氣道炎癥。吸入激素可以有效地減輕哮喘癥狀，減少哮喘發作的頻率和減輕發作時的嚴重程度，降低病死率[7]。有研究表明激素能改善氣道重塑[8-9]，然而激素減緩氣道重塑的作用尚存在爭議[10]。TGF-β1具有強烈的致纖維化作用，是哮喘氣道重塑的主要調控因子，可引起成纖維細胞、肌成纖維細胞增生，細胞外基質（ECM）合成增加、降解減少，導致氣道重塑。TGF-β1表達量增加與氣道膠原沉積面積呈正相關。本研究中觀察到早TP組、晚TP組、早BUD組干預后各項氣道重塑指標（WAm/Pbm、Wcol/Pbm、TGF-β1）較哮喘組均有改善，以早TP組改善最明顯。晚期BUD組干預效果差，與臨床上觀察到激素對已經形成氣道重塑的哮喘患者療效一致。此外，激素抵抗型哮喘患者對激素治療反應差，易發展成氣道重塑。因此，對激素抵抗型哮喘患者需早期識別，在早期使用可替代的非激素的抗炎藥物以減緩氣道重塑的發生。

研究表明，在小鼠慢性哮喘模型中，予氧化還原劑活性蛋白硫氧還蛋白-1（TRX1）干預可明顯抑制氣道重塑的發生，對已出現的氣道重塑也有減緩作用[11]。茶多酚具有超強的抗氧化作用，能直接清除超氧陰離子、羥自由基，抑制亞硝酸的形成及誘導型一氧化氮合酶mRNA的合成與轉錄，降低一氧化氮的蛋白水平及酶的活性，調節氧化/抗氧化系統的平衡[12]，從而提高抗氧化酶SOD活力，對抗自由基對血管內皮的損傷，改善微循環，減少支氣管黏膜的滲出，這些都是治療慢性哮喘的氣道重構所必需的。本研究也觀察到即使在氣道重塑建立后給予茶多酚干預，肺組織病理切片的膠原沉積等病理改變仍有改善作用。此外，與激素相比較，茶多酚不良反應小[13]，這也是其他許多治療哮喘藥物所不具備的。應用茶多酚治療能有效地清除體內的氧自由基、降低DNA的氧化損傷，抑制肺組織氣道重塑的進程，其機制可能是通過提高體內抗氧化酶SOD的活性，降低肺組織中MDA的水平，減少氣道炎性細胞浸潤，從而有效改善慢性哮喘氧化/抗氧化失衡。

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