小檗堿衍生物HB-13對角質形成細胞分泌IFN-γ的影響

楊桂蘭，李 貞，王佳媚，楊 甜，哈小琴，惠 玲，郭建魁

小檗堿是黃連的主要有效成分，具有廣譜抗菌、抗炎作用，但因口服吸收有限，臨床上主要用于治療腸道細菌感染。現代醫學研究表明小檗堿具有多方面的藥理作用，可用于治療心血管系統疾病、糖尿病、腫瘤、消化性潰瘍及肝臟疾病[1]。目前，開發新的適應證及尋找更加有效的新型衍生物成為該藥研究的熱點。HB-13是從小檗堿的眾多衍生物中篩選出的一個新的衍生化合物，其藥效和毒理學特點都源于小檗

堿，但又有量和質的變化。本研究組前期的研究表明，HB-13較原代化合物更具備明確的抗炎、抗病毒等藥理活性[2]，并可誘導角質形成細胞分泌白細胞介素（IL）-10[3]。HB-13對人體和動物的多種細胞具有生理活性。本文進一步研究了HB-13對P物質誘導的人永生化角質形成細胞（HaCaT）分泌γ干擾素（IFN-γ）的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及藥物 HaCaT細胞株由西京醫院皮膚科實驗室惠贈，HB-13(純度99.30%)及雷公藤內酯醇(T0)由中國醫學科學院皮膚病研究所藥物研究室提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 HaCaT細胞培養基DMEM/F12（Gibco公司），四甲基偶氮唑藍（MTT）及P物質（Sigma公司），IFN-γ ELISA檢測試劑盒（武漢博士德公司），熒光定量PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），全波長酶標儀（Thermo公司）， PCR儀（美國ABI公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 HaCaT細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中，每1～2天換液1次，待細胞生長至80%融合后傳代，傳代2～3次后，選擇生長旺盛、形態良好的細胞進行實驗。

1.2.2 藥物配制 用無血清DMEM/F12培養基溶解[之前先用二甲基亞砜（DMSO）助溶]HB-13與T0并配制成所需濃度（HB-13終濃度分別為2.5、5、10、20、40、80 μg/ml，T0終濃度為20 ng/ml）；P物質用無血清DMEM/F12培養基配制，終濃度為1×10-8mol/L；以上藥物置-20℃保存。

1.2.3 尋找HB-13作用于HaCaT細胞的安全濃度 將生長狀態良好的HaCaT細胞經胰酶消化并調整為2×104個/ml的單細胞懸液，傳代至96孔細胞培養板，每孔100 μl。待細胞完全貼壁后，移去原有培養液，實驗組分別加入含上述不同濃度的HB-13；對照組加入DMEM/F12培養液。每個濃度設6個復孔，數值測量及計算時取6孔的平均值。37 ℃、5%CO2培養箱孵育24 h，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液 20 μl，繼續培養4 h，吸去上清，每孔加入DMSO 200 μl，并充分振蕩使甲瓚結晶完全溶解。酶標儀490 nm處測各孔A值。

1.2.4 細胞培養上清液中IFN-γ含量的檢測 2×104個/ml的HaCaT細胞單細胞懸液，傳代至96孔細胞培養板，每孔100 μl。待細胞完全貼壁后，移去原有培養液，向培養體系中加入P物質(1×10-8mol/L)，30 min后實驗組分別加入不同濃度（2.5、5、10 μg/ml）的HB-13溶液；T0組加入20 ng/ml的雷公藤內酯醇作為陽性對照；陰性對照組中加入DMEM/F12培養液；每組設6個復孔，數值測量及計算時取6孔的平均值。分別培養12、24、48 h后，收集培養上清液，-20℃保存。采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測嚴格按試劑盒說明書進行，檢測培養上清液中IFN-γ的表達。

1.2.5 細胞內IFN-γ mRNA的檢測 ①總RNA的提取和cDNA的合成：在待測上清液中，按10 cm2（培養瓶面積）加入1ml trizol提取總RNA，嚴格按試劑盒說明操作。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的完整性，紫外分光光度計檢測總RNA的含量和純度。cDNA的合成操作嚴格按試劑盒說明書進行。②實時定量RT-PCR檢測IFN-γ mRNA：總反應體系為20 μl，包括模板cDNA 2 μl，SYBR Premix Ex Taq 10 μl，上、下游引物各（IFN-γ或β-actin）0.8 μl，ROX Reference Dye 0.4 μl，滅菌蒸餾水6 μl。擴增條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 31 s，循環40次。PCR過程設無模板陰性對照，每組3個復孔。引物如下：IFN-γ擴增片段110 bp（上游為：5'- CAT CGT TTT GGG TTC TCT TG -3'，下游為：5'-TTC CAT TAT CCG CTA CAT CT -3'）；β-actin擴增片段205 bp（上游為：5'-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3'，下游為：5'-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3'）。熒光定量RT-PCR的結果判斷以β-actin為內參照的表達強度為基準，校正值=目的基因定量結果/內參定量結果；相對定量結果=檢驗樣品的校正值/對照樣品的校正值。

1.2.6 統計學方法

采用SPSS11.5統計軟件進行處理。各組取6孔的平均值進行統計學分析。實驗數據以均數±標準差（±s）表示，數據經獨立樣本t檢驗分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 B-13的安全濃度

HB-13 的濃度為 2.5、5、10 μg/ml時，HaCaT 細胞吸光度值分別為0.982±0.041，0.980±0.043，0.979±0.042，與對照組0.982±0.037相比差異無統計學意義（P＞0.05）；而濃度為20、40、80 μg/ml時吸光度值分別為 0.728±0.052，0.564±0.053，0.323±0.053，明顯低于對照組，差異具有統計學意義（P＜ 0.01）。因此當 HB-13 濃度為 2.5、5、10 μg/ml時，HaCaT細胞生長正常，確定其為安全濃度。

2.2 培養上清液中IFN-γ含量

IFN-γ含量在不同濃度 (2.5、5、10 μg/ml)HB-13培養體系和不同培養時間上清中均較陽性對照組和陰性對照組顯著增高（均P＜0.01），而組內含量無統計學差異（P＞0.05）（表1）。

表1 HB-13對P物質刺激HaCaT細胞培養上清液IFN-γ的影響 （ ±s，pg/ml）

表1 HB-13對P物質刺激HaCaT細胞培養上清液IFN-γ的影響 （ ±s，pg/ml）

注：a:與對照組相比P＜0.01；b:與 T0組相比P＜0.01

組 別 12 h 24 h 48 h陰性對照組 42.358±7.143 43.641±8.426 42.102±2.526 T0組（20 ng/ml） 73.650±3.988 85.705±6.759 94.169±2.526 HB-13（2.5 μg/ml） 107.763±9.195ab 112.637±7.124ab 111.354±8.887ab HB-13（5 μg/ml） 111.611±4.065ab 110.328±5.604ab 115.971±7.096ab HB-13（10 μg/ml） 111.600±4.322ab 115.458±6.887ab 117.510±5.604ab

2.3 細胞內IFN-γ mRNA表達水平

細胞經不同濃度HB-13作用后，在不同時間段IFN-γ表達均較陰性對照組和陽性對照組明顯增加（P＜0.01）；但不同濃度組間無藥物濃度和作用時間的差異（P＞0.05）（表2）。

表2 HB-13對P物質刺激HaCaT細胞內表達IFN-γ mRNA的影響 （ ±s）

表2 HB-13對P物質刺激HaCaT細胞內表達IFN-γ mRNA的影響 （ ±s）

注：a:與對照組相比P＜0.01；b:與 T0組相比P＜0.01

組 別 12 h 24 h 48 h對照組 1±0.019 0.990±0.039 1.005±0.016 T0組（20 ng/ml） 1.399±0.036 1.498±0.040 1.545±0.042 HB-13（2.5 μg/ml） 1.861±0.046ab 2.013±0.050ab 1.906±0.023ab HB-13（5 μg/ml） 1.931±0.061ab 2.103±0.077ab 2.058±0.070ab HB-13（10 μg/ml） 2.012±0.070ab 2.146±0.032ab 2.175±0.032ab

3 討論

HB-13是從小檗堿衍生物中篩選出的新化合物，具有抗炎、抗病毒和抗增生活性。然而，目前對HB-13與上述活性之間的相關性及其作用機制還不明確。IFN-γ主要由Th1細胞產生，不僅有抗病毒、抗腫瘤細胞活性，而且在免疫調節中具有重要作用，是體內重要的免疫調節因子。IFN-γ可誘導rRNA合成，促進免疫細胞表面Ⅰ類和Ⅱ類組織相容性抗原的表達，增強同種K細胞、NK細胞和巨噬細胞的活性[6]。同時，IFN-γ還可激活NK細胞，刺激先天性的細胞免疫和特異性細胞毒性T細胞免疫等，從而增強其抗病毒、抗腫瘤的功能[7,8]。P物質是由神經末梢釋放的神經多肽，是過敏反應及自身免疫反應的重要遞質[4]，對免疫及炎癥反應中炎癥細胞的募集具有重要作用[5]。因此，我們選用P物質作為炎癥誘導劑。T0可能誘導細胞內IFN-γ的合成，具有明確的非特異性的抗炎作用，故本研究選用其作為陽性對照組誘導劑。其促進IFN-γ分泌的具體機制尚未闡明。

我們采用MTT法檢測了不同濃度HB-13對HaCaT細胞的毒性，實驗證明，＜10 μg/ml的HB-13對HaCaT細胞是安全濃度；同時上述濃度的HB-13對炎癥遞質P物質作用下的HaCaT細胞分泌IFN-γ均有促進作用。提示外用HB-13制劑可能通過促進皮膚角質形成細胞合成與分泌IFN-γ而發揮抗病毒、抗腫瘤、抗炎癥等藥理學作用。在本實驗所選濃度及時間范圍內，HB-13誘導HaCaT細胞分泌IFN-γ，無時間及劑量依賴性，提示HB-13在皮膚中發揮其藥理學作用的濃度范圍較廣且作用時間較長。

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