胎盤型鈣黏蛋白在尋常性銀屑病患者血清和皮損中的表達及意義

李高峰，袁皓琛

銀屑病皮損組織病理學上表現為角化不全和角化過度，角質形成細胞（KC）高度增生。KC間主要連接形式為橋粒和半橋粒連接，這種連接方式是由相鄰細胞的細胞膜發生卵圓形致密增厚而共同構成，而胞膜間隙之間重要的黏附分子胎盤型鈣黏蛋白（P-cad）是表皮連接結構中重要的黏附蛋白。P-cad介導同種細胞間的黏附反應，并通過一些信號傳導途徑導致胞內轉錄和翻譯的變化，參與細胞黏附和信號傳導過程，可引起細胞過度增生[1]。本研究分別采用酶聯免疫吸附法(ELISA)和免疫組化法檢測血清和皮損中P-cad的表達，探討P-cad在尋常性銀屑病發病中的作用及其與疾病嚴重程度的關系，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 選擇2010年1～12月在揚州市第一人民醫院和蘇北人民醫院皮膚科確診為尋常性銀屑病患者40例，其中進行期16例，穩定期15例，消退期9例；男22，女18，平均年齡（35.78±15.62）歲（17～62歲）；健康對照40名，健康對照血清來自兩所醫院皮膚科醫師、學生和實習生以及正常體檢者，其中男26名，女14名，平均年齡（33.26±11.35）歲（20～53歲）。對照組正常皮膚來自兩所醫院整形美容患者切除下的正常皮膚。排除標準：患有紅斑狼瘡、天皰瘡、皮肌炎、風濕性關節炎等自身免疫性疾病，以及其他嚴重的系統性疾病，且在3個月內曾使用過大劑量免疫抑制劑和糖皮質激素等影響免疫功能的藥物。對照組排除以上標準外尚需排除銀屑病。本實驗經本院倫理委員會通過，研究對象均簽署知情同意書。患者組和健康對照組在年齡、性別等方面差異無統計學意義（P＞0.05）。對患者的銀屑病皮損嚴重程度指數（PASI）進行評分。

1.1.2 主要試劑 人P-cad雙抗體夾心ELISA試劑盒、兔抗人P-cad（胎盤型鈣黏蛋白）、即用型SABC檢測試劑盒（羊抗兔）均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及處理 抽取患者及對照者外周靜脈血3 ml處理并保存。皮損取材：銀屑病患者選擇具有代表性的典型的原發皮損取材（患者組與對照組均取自上肢）。

1.2.2 皮損中P-cad檢測 皮損中P-cad檢測按所購試劑盒說明進行，①輪轉切片機切片，并常規脫蠟至水。②30%H2O21份+蒸餾水10份混合滅活內源性酶。蒸餾水洗3次。③熱修復抗原：將切片浸入0.01 mmol/L 枸櫞酸鹽緩沖液，加熱至沸騰，冷卻后PBS緩沖液洗滌1～2 次。④滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，不洗。⑤滴加適當稀釋的一抗，4 ℃過夜，PBS緩沖液洗2 min，共3次。⑥滴加生物素化兔抗IgG，20～37 ℃ 20 min。PBS緩沖液（pH7.2～7.6）洗2 min，共3次。⑦滴加試劑SABC，20～37 ℃ 20 min。PBS洗5 min，共4次。⑧DAB顯色。⑨ 蘇木精輕度復染，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察。

1.2.3 結果判定標準 陽性染色定位于細胞膜或細胞間連接處，并出現黃色或棕黃色的細小顆粒著色為陽性細胞。光鏡下于KC陽性染色處隨機選擇5個視野，采用雙評分方法：①根據染色強度評分：無顯色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。②根據陽性細胞所占的百分率評分：≤25%為 0分，26%～ 50%為 1分，51%～ 75%為 2分，＞75%為3分。將上述兩項所得積分相加，1～2分判為“+”，3～4分判為“++”，5～ 6分判為“+++”，“++”和“+++”視為陽性表達。

1.2.4 血清中P-cad檢測 采用雙抗體夾心ELISA法，試劑盒購自武漢博士德生物工程公司，操作步驟按試劑盒說明進行。

1.3 統計學方法

應用 SPSS13.0統計軟件進行分析，分析數據用均值±標準差（±s）表示；血清中P-cad表達組間差異采用t檢驗進行分析；正常皮膚與尋常性銀屑病皮損P-cad表達陽性率的差異采用χ2檢驗，皮損表達強度與PASI評分的相關性采用Spearman等級相關檢驗分析。P＜0.05認為差異有顯著性，P＜0.01認為差異有極顯著性。

2 結果

2.1 尋常性銀屑病患者血清中P-cad的表達

P-cad在40例患者和40名對照者血清中均有表達，尋常性銀屑病組表達為（14.27±7.85）μg/L ，而正常對照組為（4.78±3.31）μg/L，P-cad在尋常性銀屑病組血清中的表達水平顯著高于正常對照組，組間差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2 尋常性銀屑病患者血清中P-cad表達水平與PASI評分的相關性

40例尋常性銀屑病患者血清P-cad的表達水平與PASI評分（Pearson相關系數值）r=0.820，P ＜0.01，兩者呈正向線性相關（圖1）。

2.3 P-cad在尋常性銀屑病患者皮損中的表達

2.3.1 表達定位 健康對照組P-cad表達定位在表皮基底層細胞膜或細胞間連接處，棘層可見極少量表達，均呈棕黃色顆粒狀，呈不連續表達；患者組P-cad表達除在基底層有棕黃色顆粒沉積外，棘層、顆粒層均有表達，各層表達數量、強弱不等（圖2，3）。2.3.2 表達百分率 對照組和患者組表皮基底層P-cad表達陽性率均為100%，棘層及以上陽性率分別為4.64%和80.92%，患者組顯著高于對照組（χ2=30.34，P ＜ 0.01）（表 1）。

圖2 P-cad在正常對照者皮膚中的表達

圖3 P-cad在尋常性銀屑病患者皮損中的表達

表1 P-cad在銀屑病患者和正常對照者皮損中的表達 （例）

2.4 尋常性銀屑病患者皮損中P-cad表達與PASI評分的相關性

12 例尋常性銀屑病患者PASI 評分的值越高，其皮損P-cad表達強度越高。采用 Spearman等級相關檢驗分析顯示，12例尋常性銀屑病患者皮損中P-cad表達強度與 PASI評分呈正相關（r=0.615，P＜0.05）（圖 4）。

3 討論

鈣黏蛋白是細胞間連接的重要結構蛋白，是一類鈣離子依賴型跨膜黏附分子。至今已發現并證實的鈣黏蛋白超家族已超過80種，包括經典鈣黏蛋白，橋粒鈣黏蛋白等。經典鈣黏蛋白含有723～748個氨基酸，主要分為P-cad、E-cad和N-cad三大類[2]。

P-cad位于細胞邊緣，特別是細胞-細胞連接區域，通過附著蛋白與胞內蛋白結合，相鄰細胞中蛋白絲束通過P-cad和附著蛋白編織成了一個廣泛的網絡，將相鄰細胞連接在一起。王永賢等[3]和楊井等[4]研究發現，P-cad在正常人主要表達于基底層，表達微弱且不連續，其他層中未見表達；而銀屑病皮損中P-cad在表皮全層均有強表達，且兩者表達的陽性率差異有統計學意義，這與筆者的研究結果基本一致。Tinkle 等[5]和Eunkyung等[6]研究發現，通過動物實驗靶向去除小鼠表皮E-cad，結果P-cad在基底層反應性表達增加，推測銀屑病皮損處E-cad受損，P-cad表達上調是對E-cad受損起到部分代償作用，而正是這種部分代償導致上皮分化和增生的改變。另有研究表明，E-cad表達未發生變化，P-cad在銀屑病皮損中的表達顯著增強，表達模式從正常的基底層變為表皮全層[7]，認為銀屑病皮損中P-cad的這種表達模式和強度的改變可能與銀屑病表皮KC的延遲分化和過度增殖有關。

本研究對皮損中P-cad的檢測結果顯示，尋常性銀屑病患者皮損處P-cad在表皮細胞中的表達明顯高于對照組，推測P-cad可能與KC細胞的增殖有著重要的聯系。皮損部位P-cad表達增加，通過細胞間的連接體系及細胞內外的信號傳導系統，造成細胞生物學行為的變化，引起基底層和棘層這兩類表皮增生及細胞增殖周期的改變，最終導致KC細胞的增殖過度。本研究結果顯示，尋常性銀屑病患者血清中P-cad表達水平明顯高于正常對照組，且血清中P-cad的表達水平與患者的病情嚴重程度呈正相關，表明P-cad可能參與了尋常性銀屑病的發生。推測患者血清中P-cad表達水平的升高可能與銀屑病患者表皮過度增生，表皮細胞凋亡速度加快，引起蛋白質的分解增加，造成P-cad大量釋放入血液而升高有關；也可能被某些酶分解或者其他機制破壞后進入血液循環，導致血清中P-cad水平升高。

P-cad是表皮細胞間連接結構中的重要黏附分子，對表皮形態和功能的維持起著重要的作用。本研究發現其在尋常性銀屑病患者血清和皮損中的表達出現異常，說明其與尋常性銀屑病的發病存在著聯系，但具體機制尚不清楚，還有待今后進一步的深入研究。

[1]Angst B, Marcozzi C, Magee A. The cadherin superfamily:diversity in form and function [J]. J Cell Sci, 2001, 114 (4):629-641.

[2]Albelda SM. Role of integrins and other cell adhesion molecules in tumor progression and metastasis [J]. Lab Invest, 1993,68(1):4-9.

[3]王永賢, 李政霄, 彭振輝. E-鈣黏素、P-鈣黏素在進行期銀屑病皮損中的檢測 [J]. 中國皮膚性病學雜志, 2007,21(1):24-25,40.

[4]楊井, 涂亞庭. E-鈣黏素、P-鈣黏素在尋常型銀屑病皮損中的表達及其意義 [J]. 中國麻風皮膚病雜志, 2005, 21(5):343-345.

[5]Tinkle CL, LechlerT, Pasolli HA, et al. Conditional targeting of E-cadherin in skin:insights into hypeproliferative and degenerative responses [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2004,101(2):552-557.

[6]Eunkyung C, Pau WC, Charles AP, et al. Amphiregulin causes function down regulation of adherens junctions in psoriasis [J]. J Invest Dermatol, 2005, 124(6):1134-1140.

[7]Zhou S, Matsuyoshi N, Takeuchi T, et al. Reciprocal altered expression of T-cadherin and P-cadherin in psoriasis vulgaris [J].Br J Dermatol, 2003, 149(2):168-173.