復合多糖對小鼠免疫功能及抗應激能力的影響

山東寶來利來生物工程股份有限公司 廉新慧 谷 巍 劉鳳芝

近年來研究發現，生物活性多糖可參與各種生命活動調節，激活免疫細胞，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤，提高機體免疫力等作用。因此，研制生物活性多糖免疫調節劑是生物醫藥發展的重要方面之一。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌種 產朊假絲酵母、蛹蟲草、靈芝，均由寶來利來生物研究院提供。

1.1.2 試驗動物 清潔級純昆明種小鼠，體重（18±2）g，購自泰邦生物工程有限公司實驗動物中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 產朊假絲酵母培養基 斜面培養基：葡萄糖2%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，瓊脂1.6%，水，自然pH。種子培養基和發酵培養基：不加瓊脂，其余同斜面培養基。

1.2.2 酵母菌的發酵培養 取出于4℃保藏的菌種，接于斜面培養基中，在30℃下培養 48 h，進行活化。將已活化的菌種，接于已裝有種子培養基的三角瓶中于30℃、180 r／min搖床培養48 h，進行種子的擴大。將培養液離心，收集菌泥，干燥，稱重，計算生物量。

1.2.3 酵母胞壁多糖的提取 酵母溶解，凍融，超聲波破碎（吳小剛等，2006）。

1.2.4 蛹蟲草和靈芝的培養 培養方法同酵母菌，培養基為土豆20%，葡萄糖2%，磷酸氫二鉀0.3%，硫酸鎂0.15%，維生素B15～10 mg/L，pH 6.0，蟲草 25℃、靈芝 28℃培養48 h，培養液待用。

1.2.5 黃芪多糖的制備 用水煎法生產制備 （王志俊，2010）。

1.2.6 多糖含量的測定 對酵母菌破壁后的懸濁液、蛹蟲草菌絲體的培養物、靈芝菌絲體的培養物、黃芪水煎液用苯酚-硫酸法測多糖含量（張青和張天民，2004）。

1.2.7 動物分組及給藥 將小鼠隨機分為4組，每組40只，雌雄各半。4種多糖等量復配，分為3個劑量組，Ⅰ組：低劑量組（35 mg多糖/kg體重），Ⅱ組：中劑量組（70 mg多糖/kg體重），Ⅲ組：高劑量組（140 mg多糖/kg體重），對照組灌胃生理鹽水（龔曉健，2000）。根據體重按設定的劑量每天定時灌胃1次，自由采食，飲水（楊鐵虹等，2005）。試驗期為30 d。

1.2.8 小鼠生長狀況及增重率 觀察體毛、神志、飲食及活動情況。試驗期每隔10 d測一次小鼠體重。

1.2.9 免疫指標測定

1.2.9.1 免疫器官指數的測定 分別在試驗開始后11、21、31 d，稱重后處死小鼠，取出胸腺和脾臟分別稱濕重，然后計算胸腺和脾臟指數。胸腺或脾臟指數=胸腺重或脾重/體重。

1.2.9.2 巨噬細胞吞噬功能的測定 分別于試驗開始第11、21、31天飼喂后1 h，每只小鼠腹腔注射5%雞紅細胞懸液0.5 mL，8～12 h后處死，取腹腔液涂片，37℃溫孵30 min，漂洗，晾干。用姬-瑞氏混合液染色，并計算吞噬百分率和吞噬指數。

吞噬百分率/%=（吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數/200個巨噬細胞）×100；

吞噬指數/%=（被吞噬的雞紅細胞總數/200個巨噬細胞）×100。

1.2.9.3 外周血液免疫球蛋白IgG含量的測定分別在試驗開始后11、21、31 d，小鼠眼球采血1 mL，收集血清，采用小鼠 IgG酶聯免疫分析（ELISA）試劑盒測定。

1.2.10 小鼠抗應激能力的測定

1.2.1 0.1 對小鼠常壓耐缺氧的影響 雌、雄小鼠各5只，于末次給藥30 min后，將小鼠放入存有鈉石灰的密閉容器內，立即計時，以呼吸停止為死亡時間。

1.2.1 0.2 對小鼠游泳時間的影響 雌、雄小鼠各5只，于末次給藥30min后，將每只小鼠負重0.05g/g，置于20℃的水箱內，水深20 cm，計時至小鼠沉入水中的時間為游泳時間。

1.2.1 0.3 對小鼠耐高溫能力的影響 雌、雄小鼠各5只，于末次給藥30 min后，將小鼠置于46～50℃的烘箱內，觀察并記錄小鼠的存活時間。

1.3 數據處理 試驗數據采用SPSS軟件進行統計分析。

3 結果與分析

3.1 多糖含量測定結果 由表1可見，黃芪的多糖含量最高，其次是蟲草菌絲體多糖，酵母胞壁多糖和靈芝菌絲體多糖含量最低。

表1 多糖含量測定結果 mg/mL

3.2 小鼠生長狀況和增重率變化 各組小鼠在實驗前后進食量、進水量正常，被毛光澤、活動良好，反應敏捷，說明不同劑量復合多糖對小鼠生長狀況無不良影響。增重率變化見表2。

表2 小鼠增重率的變化 %

由表2可知，與對照組相比，各試驗組增重率顯著提高（P＜0.05）。在31 d時Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ劑量組分別顯著提高4.13%、11.19%、26.19%。

3.3 小鼠免疫指標測定結果

3.3.1 小鼠免疫器官指數的變化 由表3可知，對胸腺指數的影響，與對照組相比，Ⅰ組在21、31 d較對照組，分別提高9.82%和11.15%（P＜0.05）；Ⅱ組在11、21、31 d時較對照組分別提高9.27%、19.64%、20.77%（P ＜ 0.05）； Ⅲ組在 11、21 d和31 d時較對照組分別提高11.22%、29.02%、23.85%（P ＜ 0.05）。

表3 小鼠免疫器官指數的變化 mg/g

對脾臟指數的影響，與對照組相比較，Ⅰ組沒有顯著變化（P＞0.05）；Ⅱ組在21 d時較對照組提高5.6%（P＜0.05）（P＞0.05）； Ⅲ組在21 d和31 d較對照組分別提高9.26%和10.13%（P＜0.05）。

3.3.2 小鼠巨噬細胞吞噬功能的變化 由表4可知，對吞噬百分率的影響，各試驗組均顯著高于對照組（P＜0.05），在31 d時，分別較對照組提高26.05%、55.23%、72.47%。對吞噬指數的影響，各試驗組均顯著高于對照組（P＜0.05），在31 d時，分別較對照組提高11.36%、26.67%、40.32%。

表4 小鼠巨噬細胞吞噬功能的變化%

3.3.3 小鼠外周血液免疫球蛋白IgG含量的變化由表5可知，對IgG含量的影響，與對照組相比，Ⅰ組未產生顯著變化（P＜0.05）；與對照組相比，Ⅱ組在11d時顯著提高9.06%（P＜0.05）；Ⅲ組在11、21、31 d時分別顯著提高9.90%、12.28%、10.92%（P ＜ 0.05）。

表5 小鼠IgG含量的變化 μg/mL

3.4 復合多糖對小鼠抗應激能力的影響 由表6可知，各試驗組與對照組相比，小鼠的常壓耐缺氧時間，游泳時間，耐高溫時間均顯著延長 （P＜0.05）。

表6 多糖對小鼠抗應激作用的影響min

4 討論

4.1 對小鼠生存狀況及體增重的影響 多糖能夠明顯加快動物的生長，提高動物體增重，其機制是，當多糖提高動物的免疫功能之后，必然會增強動物對外來病原的抵抗作用，從而促進動物的生長。有研究表明，在飼料中添加冬蟲夏草能提高機體免疫功能，促進雞生長，提高飼料轉化率，節約單位增重的耗料量 （劉正遠等，2006；魏建忠，2005）。本試驗結果顯示，與對照組相比，三組復合多糖均能顯著提高小鼠的增重率。

4.2 對小鼠免疫器官指數的影響 胸腺和脾臟是動物的重要免疫器官。免疫器官的重量在一定程度上可反映免疫器官內淋巴細胞的數量，當動物處于應激反應衰竭期時，胸腺、脾臟及體重也相應降低，因此測定動物體重、胸腺及脾臟重量指數可反映機體免疫能力。本試驗結果可見，各試驗組胸腺指數和脾臟指數均有所增加，中、高劑量組，增加明顯。 這與姚慶志等（2011）的試驗結果一致。

4.3 對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響 巨噬細胞是一種典型的炎癥細胞，對激活劑有很高的敏感性，在微量激活劑的作用下，巨噬細胞體積可增大，吞噬活力增強。因此，吞噬細胞吞噬活性大小在一定程度上反映了機體的非特異性免疫功能。利用小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的數量，可在體外觀察巨噬細胞的吞噬功能。龔曉健等（2000）研究表明，人工蟲草胞內及胞外多糖均有增強單核巨噬細胞吞噬功能的作用。本試驗結果也顯示，不同劑量復合多糖均能顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞吞噬百分率和吞噬指數（P＜0.05）。

4.4 對小鼠IgG含量的影響 抗體是體液免疫的最終產物，IgG是血清中的重要抗體，在體液免疫中起主要作用。本試驗結果顯示，與對照組相比，各試驗組IgG含量均明顯提高。

4.5 對小鼠抗應激能力的影響 國內外研究已證實，應激能影響動物的免疫機能。大量研究表明，應激后，吞噬細胞的吞噬率和吞噬指數明顯降低，脾臟NK細胞活性和淋巴細胞對ConA刺激的增殖反應降低。這種應激引起的免疫抑制在一定時間可恢復，再次應激刺激仍可表現出抑制作用，尤其是對NK細胞活性的抑制；同時，應激對T、B淋巴細胞功能也存在抑制作用。本試驗中，各試驗組與對照組比較，小鼠的常壓耐缺氧時間，游泳時間，耐高溫時間均明顯延長，這與各試驗組對小鼠的免疫增強作用是一致的。路筱濤和鮑淑娟（2002）試驗也證實，刺梨多糖能明顯延長小鼠耐缺氧時間及游泳時間，還能提高小鼠耐高溫、耐低溫的能力，因此具有明顯的抗應激作用。

迄今為止，己有300多種活性多糖從天然產物中被分離提取。但這些被分離提取出的多糖多為植物多糖，由于微生物多糖除具有與植物活性多糖類似的結構、組成成分及生物功能外，還具有生產周期短、生產不受季節與地理條件及病蟲害限制、無毒及不污染環境等優點。把三種免疫效果較好的微生物多糖與黃芪多糖復配在一起，既節約成本，又獲得具有多種活性的復合多糖，從而實現了多糖間的互補性和協同性。

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