烏司他丁對糖尿病大鼠局灶性腦缺血的腦保護作用

李曉昶 楊改清 劉 舉 吳孟嬌 胥麗霞

鄭州市中心醫院神經內科1病區 鄭州 450000

眾所周知，糖尿病患者卒中風險高，表現在發病率及其相關病死率和再發率。氧化應激是人類和大鼠糖尿病主要的致病原因。烏司他丁具有抗氧化作用，對糖尿病大鼠腦缺血再灌注的影響未見報道。

1 材料與方法

1.1動物與分組出生后2個月的雄性健康SD大鼠90只，質量（300±20）g，由河南省實驗動物中心提供。大鼠被分為3組：（1）假手術組（M組）：血糖正常大鼠30只：缺血30min，隨后再灌注24h；（2）對照組（CD－M 組）：糖尿病大鼠，腦缺血30min，再灌注24h后再灌注24h，（3）治療組（DA組）：糖尿病大鼠30只，缺血30min立即腹腔注射烏司他丁（10U／g）。

1.2主要試劑注射用烏司他丁（天普洛安）購自廣東天普生化醫藥股份有限公司。單股尼龍栓線，無創動脈夾購自蘇州醫療器械廠。醫用低溫冰箱，圖像采集系統購自日本東芝公司。細胞色素C兔抗鼠多克隆抗體北京中山生物制劑公司。AIF引物購自武漢博士德生物工程公司。PCR試劑盒，反轉錄試劑盒購自Promega公司。

1.3糖尿病建模8周齡大鼠禁食10h，用STZ（Sigma公司）溶于0.1mol／L檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液（pH4.5），配成1%的溶液，按60mg／kg單次腹腔注射，5d后取尾靜脈血，用血糖儀測定血糖，血糖≥16.7mmolPL為糖尿病大鼠（成模率100%）。動物4d后無胰島素補充。

1.4 MCAO模型和分組大鼠仰臥，位于一個加熱墊上，直腸體溫保持在（37±0.5）℃，在頸部正中切口切開后進行常見的頸動脈及其分支揭露和剖析。左頸總動脈、左頸外動脈、左頸內動脈充分暴露。仔細分離并切斷頸外動脈分支，結扎并游離頸外動脈主干，分離頸內動脈，在頸外動脈殘端剪一小口，4－0單絲尼龍縫線與火焰圓頭通過頸外動脈的一個小切口插入。從頸外動脈的小切口插入約為18.5mm單絲尼龍縫線。缺血30min后撥除尼龍縫線，大鼠再灌注24 h后處死。MCAO模型成功標準選擇拔除尼龍縫線成活后，行走時向右側打彎或右側肢體癱瘓的大鼠。

1.5免疫組織化學檢測細胞色素C 灌注、固定、包埋、切片。每只大鼠選取皮質區5個不同高倍視野光鏡下計數。

1.6 RT－PCR檢測AIF mRNA的表達（1）組織總 RNA提取采用Trizol一步法提取組織總RNA。（2）RT反應：按試劑盒說明配制反應體系，進行逆轉錄反應cDNA20μl。（3）大鼠腦組織在液氮低溫環境下常規研磨，PCR進行擴增。擴增條件如下：96℃預變性2.5min；94℃變性45s，57℃退火30s，72℃延伸2.5min，共30個循環；72℃總延伸5 min。AIF長度為108bp，上游引物為：5＇－TAT GAC TGGAGC TGC TAA G－3＇，下游引物為：5＇－GTG GGC AAACTA CTA TCC－3＇；內參照β－actin產物大小為568bp，上游引物為：5＇－GTTTGAGACTTCAACACCCC－3＇，下游引物為：5＇－GTGGCCATCTCTCTTGCTCGAAGTC－3＇。（4）瓊脂糖凝膠電泳：取5μL擴增產物與緩沖液混合后加入瓊脂糖凝膠的加樣孔中，進行電泳，后在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，用圖像記錄分析系統進行分析。

1.7結果判斷目的基因AIF mRNA的表達量和β－actin的DNA條帶灰度值比值計算得到其相對含量。

1.8統計學處理采用SPSS 17.0軟件包進行數據處理。計量資料以均數±標準差表示，組間差異采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠腦組織細胞色素C 表達結果比較見表1。對照組和治療組大鼠腦組織缺血區細胞色素C的相對表達明顯高于假手術組（均P＜0.05），但治療組大鼠腦組織缺血區細胞色素C的相對表達明顯低于對照組（P＜0.05）。

2.2各組大鼠腦組織AIF表達結果比較見表1。對照組和治療組大鼠腦組織缺血區AIF的相對表達明顯高于假手術組（均P＜0.05），但治療組大鼠腦組織缺血區AIF的相對表達明顯低于對照組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠腦組織細胞色素C、AIF表達的比較（s，n＝6）

表1 各組大鼠腦組織細胞色素C、AIF表達的比較（s，n＝6）

注：與假手術組比較，＊P＜0.05；與對照組比較，△P＜0.05

組別 細胞色素C陽性細胞（個／HP）AIF／β－actin（OD）6.2±0.75 11.1±2.30 D－M組 103.4±6.28＊ 50.3±7.50＊D－A組 59.8±3.37＊△ 18.6±3.20 M組＊△

3 討論

烏司他丁是一種從健康成年男性尿液中分離并純化的蛋白酶抑制劑。烏司他丁由143個氨基酸組成，相對分子質量為67KD，具有多器官的保護作用。烏司他丁分子中存在著多種酶的結合位點，可同時抑制胰蛋白酶、中性粒細胞中的彈性蛋白酶、磷脂酶A、巰基酶、透明質酸酶、α－糜蛋白酶、纖溶酶等多種絲氨酸蛋白水解酶的活性并控制酶的釋放，具有穩定細胞膜電位、清除非氧及氧自由基、改變細胞內環境從而抑制溶酶體酶釋放、抑制炎性因子與炎癥相關介質的釋放作用［1－2］。通過烏司他丁作用后其主要代謝產物可阻止半暗帶區細胞死亡而發揮腦保護作用，進一步明確了其保護作用發生的分子機制，可為臨床使用自由基清除劑、改善預后，提供了一定的理論基礎。

糖尿病卒中的風險較非糖尿病患者卒中的風險增加了1.5倍到3倍，其復發中風的風險也是加倍的［3－4］。糖尿病患者對神經元的葡萄糖毒性增加導致細胞內的葡萄糖氧化，產生活性氧［5］，氧自由基可能會導致直接損害腦線粒體損傷的神經細胞。氧自由基誘導的神經元凋亡是腦缺血－再灌注后遲發性神經元死亡的基本形式［6］。在細胞凋亡中，細胞色素C和AIF都是細胞凋亡重要的調節因子。

細胞色素C是一種水溶性的蛋白質，是一種Caspase依賴性的重要的細胞凋亡調節因子，可在細胞質中充分發揮作用。正常情況下位于線粒體內膜的外側，呼吸鏈復合體Ⅲ～Ⅳ之間，調節線粒體能量代謝。當細胞缺氧、炎癥等內環境變化時，線粒體的膜通透性增加，線粒體細胞色素C可以通過細胞膜。細胞外液中的細胞色素C可與caspase家族結合并促進凋亡復合體的形成［7－8］對凋亡信號的傳導和放大作用調控細胞凋亡。AIF是一重要的非Caspase依懶性凋亡因子，在細胞質中通過與線粒體受體相結合，定位在線粒體中，啟動并誘導細胞發生凋亡作用。凋亡信號fas等的刺激下，游離的AIF通過膜電位的變換轉入細胞核，與線粒體蛋白endonuclease G一起作用于核DNA導致DNA片斷化（平均50kb）。本研究結果表明，缺血－再灌注組大鼠腦缺血區的線粒體釋放促凋亡蛋白和細胞色素C增多，而糖尿病大鼠缺血－再灌注同樣增加腦缺血－再灌注后線粒體促凋亡蛋白和細胞色素C的釋放，烏司他丁治療后的糖尿病大鼠缺血－再灌注可減低腦缺血－再灌注后線粒體細胞色素C。本研究結果亦發現，缺血－再灌注可刺激線粒體釋放促凋亡蛋白AIF，尤其在糖尿病大鼠的缺血再灌注中，而烏司他丁可以減少糖尿病大鼠腦缺血－再灌注后線粒體和細胞核中AIF的作用從而控制凋亡級聯化過程，提示烏司他丁可以通過AIF途徑抑制細胞凋亡。綜上所述，烏司他丁下調了糖尿病大鼠腦缺血－再灌注的腦組織細胞色素C、AIF的表達，從而達到減少細胞凋亡的作用。

烏司他丁對糖尿病大鼠合并急性腦梗死的腦保護作用機制可能與其抑制AIFT和細胞色素C相關的細胞凋亡有關。

［1］Oizumi R，Kanai H，Maezawa A，et al.Therapeutic effects of ulinastatin on experimental crescentic glomerulonephritis in rats［J］.Nephron，2000，84：347－353.

［2］Larrue V，von Kummer RR，Muller A，Bluhmki E：Risk factors for severe hemorrhagic transformation in ischemic stroke patients treated with recombi－nant tissue plasminogen activator：A secondary analysis of the European－Australa－sian Acute Stroke Study（ECASS II）［J］.Stroke，2001，32：438－441.

［3］Kissela BM，Khoury J，Kleindorfer D，et al.Epidemiology of is－chemic stroke in patients with diabetes：the greater Cincinnati Northern Kentucky Stroke Study［J］.Diabetes Care，2005，28：355－359.

［4］Hankey GJ，Jamrozik K，Broadhurst RJ，et al.Long－term risk of first recurrent stroke in the Perth Community Stroke Study［J］.Stroke，1998，29：2 491－2 500.

［5］付艷芹，張東銘，辛雅萍，等.α硫辛酸對糖尿病周圍神經病變的療效及對氧化應激的影響［J］.中國實用神經疾病雜志，2010，13（23）：70－71.

［6］Mastrocola R，Restivo F，Vercellinatto I，et al.Oxidative and nitrosative stress in brain mitochondria of diabetic rats［J］.Endocrinol，2005，187：37－44.

［7］Aragno M，Parola S，Brignardello E，et al.Dehydroepiandrosterone prevents oxidative injury induced by transient ischemia／reperfusion in the brain of diabetic rats［J］.Diabetes，2000，49：1 924－1 931.

［8］Rupinder SK，Gurpreet AK，Manjeet S.Cell suicide and caspases［J］.Vascular Pharmacology，2007，46：383.