內(nèi)皮型一氧化氮合成酶基因G298A、－786T＞C多態(tài)性與缺血性腦卒中的關(guān)系

楊改清 胥麗霞 劉 舉 吳孟嬌 李曉昶

鄭州市中心醫(yī)院 鄭州 450007

缺血性腦卒中（ischemic stroke，CVD）是多因素、多病因的疾病，大量研究［1］均表明基因在腦血管病中的重要作用。一氧化氮是血管內(nèi)皮產(chǎn)生的內(nèi)皮源性舒張因子，NO通過(guò)多種機(jī)制調(diào)節(jié)腦血流［2］，包括舒張血管、抑制血小板聚集、抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生和血細(xì)胞黏附、趨化，有研究表明，腦卒中存在一氧化氮依賴性舒張功能障礙［3］，而一氧化氮地合成受一氧化氮合成酶調(diào)節(jié)，因此是血管動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程重要的抑制因子。缺乏eNOS會(huì)導(dǎo)致腔隙性梗死的幾個(gè)特征性改變，如腦血管的自動(dòng)調(diào)節(jié)功能受損［4－5］、腦內(nèi)低灌注［6］、內(nèi)皮細(xì)胞損傷致血腦屏障破壞和血管重構(gòu)。由此可見(jiàn)，eNOS基因多態(tài)性的提出可能有助于腦卒中的預(yù)防。本研究在于探討一氧化氮合成酶基因位點(diǎn)上第7外顯子上G298A、啟動(dòng)子－786T＞C堿基多態(tài)性與CVD的相關(guān)性，為進(jìn)一步明確缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象隨機(jī)選取2011－03—2011－06就診于鄭州市中心醫(yī)院的缺血性腦卒中患者138例，包括大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死56例和小動(dòng)脈閉塞性腦梗死（腔隙性梗死）82例，其分型依據(jù)為中國(guó)缺血性腦卒中TOAST分型［6］，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照1995年中華神經(jīng)科學(xué)會(huì)第4屆全國(guó)腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的各類腦血管疾病診斷要點(diǎn)。所有病例均經(jīng)影像學(xué)檢查（頭CT或MRI）和我院兩位神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：瓣膜性心臟病、房顫、近期心肌梗死、血液病、腫瘤、癲、自身免疫性疾病，由炎癥、栓子、腦血管畸形或動(dòng)脈瘤等引起的繼發(fā)性腦卒中。

對(duì)照組來(lái)自研究期間在我院進(jìn)行體檢的健康人群，有心、腦血管病或糖尿病病史者均予以排除，按年齡相差5歲，性別、民族相同與病例進(jìn)行匹配，共100例。

所有研究對(duì)象均為漢族，彼此間無(wú)血緣關(guān)系。在本人知情同意情況下，對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行調(diào)查問(wèn)卷來(lái)獲取人口學(xué)特征和已知的危險(xiǎn)因素，包括種族、年齡、性別、疾病史、吸煙、飲酒等，其中吸煙、飲酒、高血壓、冠心病、糖尿病的定義參照既往研究［6］。2組一般資料見(jiàn)表1。

1.2研究方法

1.2.1 血樣采集：受檢者空腹12～15h，于次日晨6時(shí)采外周靜脈血10mL分裝3管，2管加入乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）進(jìn)行血常規(guī)測(cè)定（2mL）和生化測(cè)定（4mL），1管用于DNA提取（4mL）。血生化檢測(cè)指標(biāo)包括肝腎功能、血脂組分（總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白）等。所有檢測(cè)均采用國(guó)際通用方法和標(biāo)準(zhǔn)試劑，在我院檢驗(yàn)科完成。血液樣本在4℃條件下保存。

1.2.2 DNA提取：采用快速氯仿異戊醇法提取DNA（采用美國(guó)Promega公司提供的微量DNA提取試劑盒），提取的DNA樣品分裝后于－20℃保存。

1.2.3 引物和探針設(shè)計(jì)：eNOS基因位點(diǎn)G298A的引物為（forward）5′－CAT GAG GCT CAG CCC CAG AAC－3′and（reverse）5′－AGT CAA TCC CTT TGG TGC TCA C－3′。－786T＞C 的引物為（forward）5′－CAC CCA GGC CCA CCC CAA CT－3′and （reverse）5′－GCC GCA GGT CGA CAG AGA GAC T－3′。

1.2.4 PCR－RFLP法檢測(cè)基因型：20μL PCR體系中，含有0.1μg基因組 DNA 模板，2mM MgCl2，0.2uM 引物，200 uM dNTP及0.5U 的 Taq酶。2xTaq PCR Master Mix購(gòu)買自寶生物D512A。E298DPCR條件為：95℃3min，之后（94℃45s，59℃45s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)）72℃10min。取5μL PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)E298D，10μL PCR產(chǎn)物加1μL 10xbuffer和0.5μL Mbo I，37℃處理過(guò)夜，電泳檢測(cè)；G等位基因?yàn)?06bp和的條帶，T等位基因?yàn)?19bp和87bp的條帶。－786T＞CPCR條件為：95C3min，（94℃30s，61℃30s，72℃35s，35個(gè)循環(huán)），72℃10min；取5μL PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)10μL PCR產(chǎn)物加1μL 10xbuffer和0.5 μL Mbo I，37℃處理過(guò)夜，電泳檢測(cè)；T等位基因基因片段長(zhǎng)度為415bp，而C為370bp和45bp兩個(gè)片段。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SAS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。臨床參數(shù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，分別用t檢驗(yàn)和卡方（χ2）檢驗(yàn)比較計(jì)量資料和計(jì)數(shù)資料。為考察資料的可靠性對(duì)2組基因型分布進(jìn)行Hardy－Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)，基因型頻率和等位基因頻率差異采用卡方檢驗(yàn)，采用logistic回歸平衡協(xié)變量（年齡、性別、吸煙、飲酒、血脂、空腹血糖）計(jì)算OR值比及其95%CI，P＜0.05（雙側(cè)）認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組臨床特征比較2組進(jìn)行年齡和性別匹配，有差異的危險(xiǎn)因素有吸煙（OR＝4.1818，95%CI 2.3066－7.5814）、收縮壓、舒張壓及既往慢性病史。見(jiàn)表1。

表1 2組一般資料比較

2.2 eNOS在2組的分布eNOS上 G298A、4b／a和786C2 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P 值分別為：0.80、0.26和0.97，提示eNOS基因型在缺血性腦卒中患者與健康人群中的分布無(wú)差異，以多元逐步條件Logistic回歸分析，調(diào)整吸煙、血脂、血壓、既往慢性病史，2組比較差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.5）。結(jié)果見(jiàn)表2。

G298A和786C的基因型在病例組和對(duì)照組之間分別存在GG純合、GT雜合、TT純合，T純合、TC雜合、CC純合3種基因型，2組的基因型頻率經(jīng)χ2檢驗(yàn)，均符合 Hardy－Weinberg平衡。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 eNOS在病例組和對(duì)照組的基因型分布

2.3 eNOS等位基因在2組的分布三種等位基因在缺血性腦卒中患者和健康人群之間的分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示G、T可能是顯性基因，4b是健康人群中正常存在基因形式。見(jiàn)表3。

表3 eNOS等位基因在病例組和對(duì)照組的分布

3 討論

目前已被證實(shí)的腦血管疾病的危險(xiǎn)因素包括：老年、男性、吸煙、高血壓、肥胖、血脂異常、糖尿病和高同型半胱氨酸血癥，從表1中可以看出，吸煙、收縮壓、膽固醇及低密度脂蛋白在病例組與對(duì)照組間存在明顯差異，在綜合考慮基因和環(huán)境因素的基礎(chǔ)上，上述因素仍是缺血性腦卒中重要的危險(xiǎn)因素。

一氧化氮合成酶共有3中類型：內(nèi)皮型、神經(jīng)型及誘導(dǎo)型。一氧化氮（NO）主要由內(nèi)皮型eNOS調(diào)節(jié)，其在抗動(dòng)脈粥樣硬化及腦血流調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵性作用，并最終影響梗死面積。eNOS催化L－精氨酸生成NO和瓜氨酸［7］。人類一氧化氮合成酶基因位于人類第7條常染色體上。人eNOS含有1203個(gè)氨基酸，其基因?yàn)閱慰截悾ㄎ挥谌旧w7q352q36，全場(chǎng)21－22kb，包括26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子。第7外顯子G894T突變使編碼的第298位谷氨酸（G，等位基因G）被天門冬氨酸（Asp，等位基因T）所取代），使eNOS構(gòu)象改變，從而使eNOS酶活性下降，NO生成減少［8］；而啟動(dòng)子－786位點(diǎn)上T－C等位基因的突變同樣也導(dǎo)致NO生成減少。

內(nèi)皮一氧化氮合酶基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的研究已經(jīng)在多種不同人群中廣泛開(kāi)展，但研究結(jié)果卻大相徑庭。目前我國(guó)國(guó)內(nèi)這方面研究也越來(lái)越多。有研究提示G298T的基因突變會(huì)導(dǎo)致缺血性腦卒中發(fā)病率增加，如Elbaz等［8］和Saidi S等［9］對(duì)北非突尼斯國(guó)的研究發(fā)現(xiàn)，298位點(diǎn)上G到T的突變會(huì)增加腦卒中的發(fā)病率，一項(xiàng)在匈牙利的試驗(yàn)同樣也支持上述結(jié)論［10］。這機(jī)制可能是該位點(diǎn)的基因突變導(dǎo)致eNOS活性降低，從而導(dǎo)致NO合成減少而增加血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷；然而，Majumdar等對(duì)南印度的研究［11］卻表明一氧化氮合成酶基因與缺血性腦卒中變化無(wú)相關(guān)，但若將一氧化氮合成酶基因和亞甲基四氫葉酸還原酶基因或血管緊張素基因聯(lián)合考慮時(shí)，則顯示TT是缺血性腦卒中的危險(xiǎn)基因型，且不受環(huán)境因素的影響。我們的研究結(jié)果也未發(fā)現(xiàn)一氧化氮合成酶基因G298A多態(tài)性在缺血性腦卒中中的作用。這個(gè)結(jié)果提示基因?qū)CVD的作用可能是獨(dú)立起作用，是各個(gè)基因、基因與環(huán)境之間的相關(guān)作用。

－786T＞C與CVD：Giorgio等曾證實(shí)了CC是顱內(nèi)動(dòng)脈硬化的危險(xiǎn)因素［12］，這為其是缺血性腦卒中的危險(xiǎn)基因提供了依據(jù)。Howard TD等［13］研究發(fā)現(xiàn)，攜帶786TT的黑人女性患缺血性腦卒中的幾率是無(wú)此基因女性的3倍，而在白人女性中則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這種聯(lián)系。Moe KT等［14］在新加坡人群的研究和Piao等對(duì)我國(guó)漢族人的研究［15］結(jié)果也提出初次缺血性腦卒中與一氧化氮合成酶（NOS）無(wú)明顯關(guān)系，同樣，我們的試驗(yàn)也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這種聯(lián)系。考慮產(chǎn)生這些相互矛盾的結(jié)論的原因有：研究樣本選擇不統(tǒng)一、樣本量不同、研究人群種族和地域差別等。

缺血性腦卒中是危害老年人健康的一種常見(jiàn)病，隨著人口的老齡化，老年缺血性腦卒中的發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)。我國(guó)屬于世界上腦卒中高發(fā)國(guó)家之一［16］，2005－11WHO統(tǒng)計(jì)分布全球腦卒中死亡人數(shù)為560萬(wàn)，我國(guó)的腦卒中死亡人數(shù)排在第二位，為180／10萬(wàn)［17］。因此，研究缺血性腦卒中的危險(xiǎn)因素，特別是基因多態(tài)性對(duì)預(yù)防該疾病有重要意義。目前關(guān)于eNOS基因與缺血性腦卒中的研究較多，但結(jié)論不一致。為進(jìn)一步明確一氧化氮合成酶基因在缺血性腦卒中中的作用，需要更多的大樣本臨床研究和分子生物學(xué)研究。

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